Реснички вектор: Изображения Ресницы | Бесплатные векторы, стоковые фото и PSD — DesignLessons – все о дизайне

Содержание

%d1%80%d0%b5%d1%81%d0%bd%d0%b8%d1%86%d1%8b PNG, векторы, PSD и пнг для бесплатной загрузки

Мемфис дизайн геометрические фигуры узоры мода 80 90 х годов

4167*4167

аудиокассета изолированные вектор старая музыка ретро плеер ретро музыка аудиокассета 80 х пустой микс

5000*5000

поп арт 80 х патч стикер

3508*2480

поп арт 80 х патч стикер

3508*2480

Мемфис шаблон 80 х 90 х годов стилей фона векторные иллюстрации

4167*4167

поп арт 80 х патч стикер

3508*2480

диско дизайн в стиле ретро 80 х неон

5556*5556

80 летний юбилей дизайн шаблона векторные иллюстрации

4083*4083

поп арт 80 х патч стикер

2292*2293

Мемфис бесшовные модели 80 х 90 х стилей

4167*4167

поп арт 80 х патч стикер

3508*2480

три группы 3d реалистичное декоративное яйцо с золотым цветом на гнезде bd с золотым всплеском текстовый баннер

5000*5000

Мемфис шаблон 80 х 90 х годов на белом фоне векторная иллюстрация

4167*4167

80 е брызги краски дизайн текста

1200*1200

Дизайн персонажей моды 80 х годов может быть коммерческими элементами

2000*2000

мемфис бесшовной схеме 80s 90 все стили

4167*4167

поп арт 80 х патч стикер

3508*2480

в первоначальном письме bd логотипа

1200*1200

80 летие векторный дизайн шаблона иллюстрация

4167*4167

поп арт 80 х патч стикер

2292*2293

ретро стиль 80 х годов диско дизайн неон плакат

5556*5556

80 х годов ретро слово градиент цвета искусства

1200*1200

Мода цвет 80 х годов ретро вечеринка слово искусства

1200*1200

bd письмо 3d круг логотип

1200*1200

Ретро ТВ игра 80 х годов в стиле арт дизайн

1200*1200

Ретро мода неоновый эффект 80 х тема художественное слово

1200*1200

Рождество 80 х годов ретро пиксель

9449*5315

Тенденция персонажа мультфильма 80 х годов

2000*2000

Модный стиль ретро 80 х годов дискотека тема искусства слово

1200*1200

Диско вечеринка в стиле ретро 80 х art word design

1200*1200

облака комиксов

5042*5042

рисованной радио 80 х

1200*1200

80 основных форм гранж

1200*1200

ТВ игра 80 х неоновый эффект слово дизайн

1200*1200

80 е в стиле ретро мода цвет градиент арт дизайн

1200*1200

Мода стерео ретро эффект 80 х годов тема искусства слово

1200*1200

80 летнего юбилея векторный дизайн шаблона иллюстрация

4083*4083

80 х годов мода цвет неоновый эффект слово дизайн

1200*1200

в первоначальном письме bd логотип шаблон

1200*1200

в первоначальном письме bd шаблон векторный дизайн логотипа

1200*1200

Ретро музыка вечеринка 80 современный стиль искусства слова

1200*1200

мемфис бесшовной схеме 80s 90 все стили

4167*4167

Ретро стиль 80 х вечеринка тема слово дизайн

1200*1200

Градиент ретро 80 х годов дискотека тема слово искусство

1200*1200

ретро 80 х годов стиль текста эффект макет

3000*3000

Ностальгическая ретро лента 80 х клипарт

1200*1200

круглая буквица bd или db дизайн логотипа вектор

5000*5000

№ 86 логотип который выглядит элегантно и присоединиться

5000*5000

80 х годов поп арт мультфильм банановая наклейка

8334*8334

ТВ игра 80 х в стиле ретро

1200*1200

обзор 9 видов щеточек с фото

За счет чего тушь удлиняет ресницы, создает объем и эффект густоты? Конечно, важна формула. Но за результат во многом отвечает и щеточка

Содержание:

Выбирать тушь, хорошенько изучив то, что написано на упаковке, — правильный, но не всесторонний подход. Помимо обещанного на этикетке эффекта и списка ингредиентов важны параметры щеточки — их стоит оценить еще перед покупкой. На примере средств L’Oréal Paris расскажем подробнее о том, какими бывают щеточки и чего с их помощью удается добиться в макияже.

Тушь Telescopic: гибкая и тонкая щеточка-расческа

Тушь Telescopic, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

Эта тушь L’Oréal Paris действительно придает ресницам объем и длину, но эффект получается мягким — в самый раз для casual-макияжа. Щеточка у нее соответствующая: удлиненная, с несколькими ровными рядами одинаковых щетинок, которые «прочесывают» все реснички, равномерно распределяя по ним тушь.

Они же отвечают за безупречное разделение — слипшихся ресниц и комочков не будет. Гибкость пластиковой щеточки делает ее очень комфортной в использовании.

Тушь Volumissime: прямая щеточка с густой щетиной

Тушь Volumissime, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

Щеточка напоминает ту, что у туши Telescopic, своей аккуратной симметрией. Но различия все же существенны. Начнем с того, что это не пластиковый аппликатор, а щеточка с густой щетиной, длина которой позволяет получить wow-эффект — густо прокрасить ресницы и обеспечить им серьезный объем. При этом в ходе нанесения, опять же, удается избежать образования комочков и склеивания, щеточка Volumissime успешно разделяет ресницы, гарантируя аккуратный макияж.

Тушь Bambi Eye Oversized: Силиконовая щеточка

В случае с Bambi Eye Oversized, L’Oréal Paris, можно ожидать эффекта накладных ресниц и изящного изгиба. Взгляд будет как у Бэмби, на что намекает само название туши. Секрет — в асимметрии щеточки: ближе к основанию щетинки длиннее и гуще. Они отвечают за XXL-длину ресничек и придают взгляду выразительность, если их хорошо прокрасить. Ресничкам щеточка Bambi Eye задает определенный вектор, зачесывая их наверх, что усиливает впечатление от макияжа.

Тушь Miss Baby Roll: спиралевидная щеточка

Тушь Miss Baby Roll, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

С Miss Baby Roll керлер можно будет отложить. У этой туши — особая щеточка со спиральным расположением щетинок разного размера и длины, что позволяет подкручивать ресницы, приподнимая их у корней и придавая им выразительный изгиб. Щеточка качественно и равномерно прокрашивает ресницы, создавая дополнительный объем.

Тушь Volume Million Lashes So Couture: кисточка с густой щетиной

Тушь Volume Million Lashes So Couture, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

От туши Volume Million Lashes So Couture можно ожидать результата, достойного образа с дресс-кодом black tie — кутюрного макияжа ресниц с изящным изгибом плюс объема и аккуратного разделения. Чтобы эффект был именно таким, L’Oréal Paris создали щеточку с густой и достаточно длинной щетиной, которая хорошо «прочесывает» реснички и аккуратно прокрашивает их, не допуская склеивания, не оставляя комочков и помарок, которые в вечернем макияже недопустимы.

Тушь Volume Million Lashes Feline

Тушь Volume Million Lashes Feline, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

Эффект «кошачьего» взгляда, пожалуй, один из самых желанных. В случае с Volume Million Lashes Feline он гарантирован: все дело в кисточке с изгибом, который позволяет заметно завить реснички у внешних уголков глаз. Именно они, изящно подкрученные, и создают тот самый эффект cat eyes. Если еще и над техникой нанесения туши поработать, а именно — постараться зачесать их по направлению к вискам, получится легкий прищур, благодаря которому взгляд становится магнетическим.

Тушь Paradise Extatic

Тушь Paradise Extatic, L’Oréal Paris © loreal-paris.ru

Объем и удлинение плюс уход — Paradise Extatic обволакивает ресницы хорошо пигментированной формулой с касторовым маслом, которое укрепляет и способствует их росту. А щеточка с волнообразными изгибами и мягкими щетинками примерно одинакового размера по всей длине обеспечивает мягкое и комфортное нанесение средства.

Тушь Unlimited

Тушь Unlimited, L’Oréal Paris © loreal-paris. ru

Цель этой туши L’Oréal Paris — изящный изгиб и эффект лифтинга. В том, чтобы результат получался именно таким, важную роль играет уникальная щеточка-трансформер, которая легко меняет положение и прокрашивает даже самые короткие реснички, подхватывая их от корней.

Рейтинг: туши L’Oréal Paris с лучшими, по мнению редакции, щеточками

Конечно, их трудно сравнивать между собой: каждая тушь L’Oréal Paris по-своему особенная, формулы в дуэте с кисточками позволяют добиться самых разных спецэффектов, каким бы ни был бьюти-запрос. Однако есть среди этих средств те, что выделяются из общего числа.

Так, Bambi Eye Oversized, за счет эластичной формулы с коллагеном позволяет добиться экстрадлины, а ее ассиметричная кисточка еще и «вытягивает» ресницы, закрепляя результат.
У Miss Baby Roll — другая суперсила: тушь способна подкручивать ресницы не хуже специальных щипчиков, делая взгляд невероятно притягательным.
А Telescopic — универсальный вариант для тех, кому нужен не явный акцент на ресницы, а легкое удлинение и увеличение объема, достаточные для ежедневного макияжа.

А вы обращаете внимание на щеточку при выборе новой туши? Напишите о своем опыте в комментариях.

Оксидант InLei

Краска для бровей, ресниц и бороды RefectoCil

Краска для бровей, ресниц и бороды RefectoCil Любому человеку хочется выглядеть привлекательно при минимуме усилий и затрат как временных, так и денежных. Мировые «светила» в индустрии красоты, все как один, твердят: естественная красота всегда в моде, всегда актуальна, всегда должна быть! Ее нужно уметь раскрыть и подчеркнуть.

Основой красивого лица и женщин, и мужчин, являются брови и ресницы (выразительные глазки всегда покоряют сердца). У мужчин дополнительным «атрибутом» привлекательности служит борода: ухоженная, красивой формы и цвета. Для того чтобы подчеркнуть ваши естественные изящные брови, пушистые ресницы и, возможно, брутальную бороду, экспертами разработана краска для бровей, ресниц и бороды RefectoCil. Доступность данного «инструмента красоты» приятно удивляет, цена краски для бровей RefectoCil радует, качество приводит в восторг. На резонный вопрос: « Где же купить краску для бровей RefectoCil ?» ответ очевиден – на сайте colibriesthetic.ru. Покупая краску для ресниц RefectoCil сегодня, вы обеспечиваете свою естественную привлекательность на каждый день! Почувствуйте себя на вершине мира красоты, благодаря краске RefectoCil. Внимание!!! ВАЖНАЯ ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ВАС И ВАШИХ КЛИЕНТОВ!!! Краску торговой марки RefectoCil необходимо разбавлять ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО оксидантом Рефектоцил.

НЕДОПУСТИМО при окрашивании использовать средства разных торговых марок! Активные компоненты косметических средств одной и той же марки ЛУЧШЕ И ЭФФЕКТИВНЕЕ сочетаются друг с другом, что является ГАРАНТИЕЙ ВЕЛИКОЛЕПНОГО 6-ти НЕДЕЛЬНОГО РЕЗУЛЬТАТА!

VECTOR

Скачать брошюру

VECTOR — культиватор для мелкой пожнивной обработки и глубокого рыхления

VECTOR является одним из самым многосторонних культиваторов на рынке сегодняшнего дня, предназначеный для мелкой пожнивной обработки и глубокого рыхления почвы.

Идеально для обработки паров

Предпосевная обработка по пашне
Рыхление и вентилирование почвы весной
Первая мелкая обработка по стерне после уборки
Вторая обработка по стерне с созданием мульчирующего слоя
Глубокое рыхление до 40см
Заделка жидкой и твердой фракции навоза
Посев сидератных культур / мелкосемянных трав как горчица, люпина (оснащения орудия пневматической сеялкой Speed Drill)

Вносит минеральные удобрения поверхностно или в глубину (оснащение системой Boxer)

	VECTOR настройка глубины обработки Четырехрядный универсальный культиватор для мелкой пожнивной обработки и глубокого рыхления почвы. Уникальность орудия VECTOR заключается в блоке гидравлической настройки глубины с помощью которого можно бесступенчато регулировать глубину обработки без необходимости остановки и выхода из трактора. Будь то заросшие сорняком или утрамбованные кромки полей, глубокие колеи или кучи соломы, тракторист имеет возможность отреагировать на это путем изменения глубины обработки, достигая при этом самого оптимального результата
	VECTOR рабочие органы VECTOR — оснащается быстросьемными рабочими органами, системы ТопМикс. Набор лап, лемехов многосторонний, для возможности работы мелко с задержкой влаги до лап глубокого рыхления. Для правильного подбора нужных вам лап, обращайтесь к нашему коллективу — мы всегда будем рады помочь Вам!
	VECTOR расширение или уменьшение ширины захвата VECTOR имеет возможность модульного расширения рабочей ширины. Таким образом трактором 300л.с. ведется стерневая обработка 8м орудием, для более глубокой обработки требуется отстегнуть боковые секции и редуцировать рабочую ширину на 5,7м По этому принципу работает VECTOR 4,6м -> 6,2м с возможностью модульного расширения рабочей ширины По этому принципу работает VECTOR 7,0м -> 9м с возможностью модульного расширения рабочей ширины
	VECTOR с рабочей шириной 9м Для тракторов с большой мощностью фирма KÖCKERLING предоставляет возможность увеличения рабочей ширины до 9м Вносит минеральные удобрения поверхностно или в глубину (оснащение системой Boxer)

Комплектация орудия VECTOR:

телескопическое/выдвижное дышло для работы со спаренными колесами на тракторе
передние опорные колеса для стабилизации и соблюдения точности глубины обработки
четырехрядное расположение рабочих органов — TopMix долото 80 x 14 mm и стрельчатая лапа 310 mm
разравнивающие нивеляторы за последним рядом рабочих органов
разравнивающий щит — Crossboard перед тандемным катком СТС
тандемный каток для выдержки глубины, крошения комьев и обратного уплотнения STS — каток Ø 530 mm
задняя регулируемая сетчатая борона для оптимального распределения соломы 600 mm x Ø 13 mm
выравнивания и крошения структуры почвы.

Общие данные:

тяговая потребность: от 40 л.с. до 60 л.с./м ширины захвата

Технические данные

	VECTOR 460	VECTOR 570	VECTOR 620	VECTOR 800	VECTOR 900
Конструкция	со складыванием	со складыванием	со складыванием	со складыванием	со складыванием
Рабочая скорость	8 — 15 км/ч
Максим.транспортная скорость	25 км/ч
Ширина захвата	4,60 м	5,70 м	6,20 м	8,00 м	9,00 м
Высота рамы	85 см	85 см	85 см	85 см	85 см
Количество рядов лап	4-хрядное	4-хрядное	4-хрядное	4-хрядное	4-хрядное
Количество рабочих органов	17	21	23	29	33
Количество нивеляторов	8	10	12	14	16
Шины	Опорные колеса: 380/55/17″ Транспортные колеса: 500/55/20″
Тяговая потребность от:	184 кВт	220 кВт	243 кВт	272 кВт	294 кВт
	250 л. с.	300 л.с.	330 л.с.	370 л.с.	400 л.с.
Транспортная длина	9,00 м	9,00 м	9,00 м	9,00 м	9,00 м
Транспортная ширина	3,00 м
Транспортная высота	2,50 м	2,50 м	2,80 м	2,80 м	2,90 м
Вес	5910 кг	7200 кг	7750 кг	8900 кг	9200 кг

Новый метод получения живых изображений ресничек дыхательных путей человека с использованием агглютинина зародышей пшеницы

Трахея мыши

Пять мышей (штамм C57BL / 6, возраст 12 недель, самки) были умерщвлены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Киото. шейный вывих и трахеи. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с установленными Руководством по экспериментам на животных, Законом правительства Японии о защите и контроле над животными и Уведомлением правительства Японии о кормлении и сохранении животных.

Трахея человека

Трахеи человека были получены от 13 пациентов, перенесших ларингэктомию для лечения дисфагии, злокачественных опухолей глотки, гортани, пищевода и языка и стеноза подсвязочного канала. Перед ларингэктомией 4 и 4 пациента получили облучение шейки матки и трахеотомию в течение 2 лет соответственно. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов до операции, и это исследование было одобрено этическим сообществом больниц Киотского университета (R1204-2) и проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями больниц Киотского университета.

Флуоресцентная маркировка трахей

Трахеи разрезали на полоски, а затем прикрепляли к пластиковым чашкам с помощью Vetbond (3 M, Maplewood, MN, USA) так, чтобы их просветные стороны были обращены вверх. После промывания средой Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), образцы инкубировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 8 мкг / мл FITC-WGA (Vector Laboratories, Burlingame, CA, США) на 1 час. Неприкрепленный FITC-WGA удаляли промывкой DMEM с высоким содержанием глюкозы.

Наблюдение за движением ресничек

Прямой микроскоп (BX-51; Olympus, Токио, Япония), оснащенный водно-иммерсионным объективом × 60 (Olympus) и высокоскоростной камерой (FASTCAM mini UX50; Photron, Токио, Япония), использовали для наблюдения за движением ресничек (рис. 1). Трахеи мыши и человека, окрашенные FITC-WGA, помещали в среду DMEM / F-12, не содержащую фенолового красного (Nacalai Tesque, Киото, Япония), и люминальные поверхности трахеи наблюдали с помощью проходящего света и / или эпифлуоресцентного освещения.Изображения движения ресничек были получены с помощью высокоскоростной камеры с частотой кадров 50 или 125 кадров в секунду.

Анализ частоты биений ресничек

Движение ресничек в трахее человека регистрировали с частотой 125 кадров в секунду. Среднее значение CBF в записанной области анализировали с использованием подключаемого модуля ImageJ ciliaFA (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) ²⁸. Статистические различия между CBF в неокрашенных и окрашенных FITC-WGA трахеях мыши анализировали с помощью теста Стьюдента t-. P <0,05 считалось значимым отличием.

Анализ направления и оси биений ресничек

Направления и оси движения ресничек в каждой ресничной клетке измеряли с помощью ImageJ. Измерения проводились по крайней мере для 15 клеток с ресничками в одном поле зрения (приблизительно 210 × 170 мкм). Диаграммы Rose были созданы с использованием Octave (https://www.gnu.org/software/octave/), чтобы показать распределение направлений и осей. Стандартное отклонение направления биения ресничек определялось с помощью следующих уравнений: ²⁹:

$$ v = \ mathrm {cos} \ theta + i \ mathrm {sin} \ theta $$

(1)

$$ R = \ mathrm {abs} (\ frac {1} {N} \ sum_ {j} {v} _ {j}) (j = 1, 2, 3, \ dots, N) $$

(2)

$$ S = \ sqrt {-2 \ mathrm {ln} R} $$

(3)

, где направления биения ресничек считались единичными векторами, v — единичный вектор в комплексной плоскости, θ — направление биений ресничек, i — мнимая единица, R — длина среднего значения единицы. векторов, N — количество измеренных ячеек, а S — стандартное отклонение.

Сканирующая электронная микроскопия

После наблюдения за движением ресничек трахеи человека предварительно фиксировали 2% (мас. / Об.) Формальдегидом и 2,5% (мас. / Об.) Глутаровым альдегидом в 100-мМ HEPES [4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота) в течение 24 ч при 4 ° C и после фиксации с использованием 1% тетроксида осмия. Фиксированные образцы были обезвожены с использованием возрастающих концентраций этанола (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% и 100%). Этанол заменяли трет-бутиловым спиртом, а затем образцы сушили вымораживанием.На образцы напыляли платино-палладиевый сплав с использованием ионного устройства для нанесения покрытий (IB-3; Eiko, Tokyo, Japan), а поверхности просвета наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа (S-4700; Hitachi, Токио, Япония).

Добавить: pEF5B-FRT-cilia-APEX

Эти плазмиды созданы вашими коллегами. Пожалуйста, примите во внимание Главный исследователь, процитируйте статью, в которой были описаны плазмиды: и включите Addgene в Материалы и методы ваших будущих публикаций.

Для вашего Материалы и методы раздел:
pEF5B-FRT-реснички-APEX был подарком от Максенс Начури (Плазмида Addgene # 73186; http: // n2t.сеть / addgene: 73186; RRID: Addgene_73186)
Для вашего Ссылки раздел:
Протеомика первичных ресничек по метке близости . Мик Д.Ю., Родригес РБ, Лейб Р.Д., Адамс К.М., Чиен А.С., Гиги С.П., Начуры М.В. Dev Cell. 2015 23 ноября; 35 (4): 497-512. DOI: 10.1016 / j.devcel.2015.10.015. Epub 2015 12 ноября 10.1016 / j.devcel.2015.10.015 PubMed 26585297

Michelle Cilia: USDA ARS

Мы заинтересованы в понимании сложной взаимосвязи между вирусами, насекомыми-переносчиками и растениями-хозяевами, уделяя особое внимание вирусам, поражающим мелкие зерновые культуры.Основной упор делается на использование комбинации молекулярного, генетического и протеомного подходов для понимания того, как тля и растения регулируют процесс передачи вируса. Вторая область — это разработка новых инструментов борьбы с вредителями для усиления контроля над культурами и предоставления новых стратегий борьбы с вирусными заболеваниями растений. В нашей лаборатории мы изучаем вирусы, переносимые тлей-переносчиками.

Вирусы растений передаются насекомыми двумя разными способами. Потивирусы связываются с ротовыми частями тли и быстро передаются новым хозяевам во время кормления.Однако представители Luteoviridae перед передачей циркулируют по телам своих тлей-переносчиков. Последний механизм называется циркуляционной передачей и основан на серии регулируемых во времени и пространстве белковых взаимодействий внутри тела тли и во флоэме растений-хозяев. Мы применяем множество современных технологий, включая масс-спектрометрию, высокопроизводительное секвенирование ДНК / РНК, конфокальную микроскопию, молекулярную генетику и двухмерный флуоресцентный гель-электрофорез для изучения передачи вируса растений тлей.

Некоторые белки, участвующие в передаче вируса тлями, имеют практическое применение, поскольку они служат надежными биомаркерами для идентификации популяций тлей, которые могут эффективно передавать вирусы. Эти белки являются первыми биомаркерами компетенции вектора для передачи патогенов. Эта работа открывает дверь к новым вирусам и комплексным стратегиям борьбы с вредителями, позволяя полностью модернизировать методы борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Используя масс-спектрометрию, мы разрабатываем целевые методы для количественного определения пептидов, которые позволяют различать эффективные и бедные популяции насекомых-переносчиков.Мы сотрудничаем с учеными Вашингтонского университета в Сиэтле и Международного института тропического сельского хозяйства в Африке, чтобы превратить эти методы в полезный инструмент для борьбы с вирусными заболеваниями и профилактики основных продовольственных культур в Африке и других странах мира.

Публикации

Реснички M , Peter K, Bereman M, Howe K, Fish T, Smith D, Gildow F, MacCoss MJ, Thannhauser T, and Gray S (2012) Discovery и целенаправленная ЖХ-МС / МС очищенного полеровируса выявляет различия во взаимодействии вируса с хозяином, связанные с измененной передачей тлей. PLoS One, принято с незначительными изменениями.

Chavez JD *, Cilia M *, Weisbrod CR, Ju HJ, Eng JK, Gray SM и Bruce JE (2012) Измерения перекрестного связывания вируса скручивания листьев картофеля выявляют топологии взаимодействия белков, необходимые для стабильности вириона и передачи тли и взаимодействия вируса с растением. J. Proteome Res. 11: 2968-2981. * Соавторы.

Cilia, M , Bereman, M, Fish, T, MacCoss, M, and Gray, S. (2012) Векторные биомаркеры гомоптерановых для циркулирующей передачи вируса растений экспрессируются у нескольких видов тлей и белокрылки Bemisia tabaci.Журнал интегративного сельского хозяйства, специальный выпуск: комплекс видов белокрылки Bemisia tabaci и бегомовирусы, 11 (2): 249-262.

Реснички, М , Хау, К., Фиш, Т, Смит, Д., Махони, Дж., Тамбориндеги, К., Берд, Дж., Таннхаузер, Т. и Грей, С. (2011) Открытие биомаркеров сверху вниз белковые биомаркеры для эффективной передачи вируса насекомыми (Homoptera: Aphididae), обнаруженные путем сочетания генетики и 2-D DIGE, Proteomics, 11: 2440-58 [размещены на обложке выпуска].

Реснички, M , Tamborindeguy, C, Fish, T, Howe, K, Thannhauser, T and Gray, S.(2011) Генетика в сочетании с количественной интактной протеомикой связывает наследственную экспрессию белков тли и эндосимбионтов с циркуляционной передачей полеровируса. J. Virology 85: 2148-2166 [на обложке выпуска]

Cilia, M , Tamborindeguy, C, Rolland, M, Howe, K, Thannhauser, T. и Gray, S. (2011) Ощутимые преимущества Секвенирование генома гороховой тли и аннотация для протеомики тли: улучшения в идентификации белков и валидации данных для протеомики на основе гомологии.J. Физиология насекомых, 57: 179-190.

Реснички, M , Fish, T, Yang, X, McLaughlin, M, Thannhauser, TW и Gray, S (2009) Сравнение методов экстракции белков, подходящих для протеомных исследований белков тли на основе геля. J Biomol Tech 20: 201-15.

Benitez-Alfonso, Y, Реснички, M , San Roman, A, Thomas, C, Maule, A, Hearn, S. и Jackson, D. (2009) Контроль развития меристемы Arabidopsis посредством тиоредоксин-зависимой регуляции межклеточный транспорт.Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3615-20.

Cilia, M (2009) На пути к поддержанию женщин через критические переходные моменты в научной карьере: итоги семинара. J Biomol Techniques 19: 353-55.

Реснички, ML и Jackson, D (2004) Форма и функция плазмодесм. Curr Opin Cell Biol 16: 500-6.

Cilia, M , Cantrill, L и van Bel, A. (2002) Plasmodesmata 2001: На сафари через симпласт. Растительная клетка 14: 7-10.

Kim, JY, Yuan, Z, Cilia, M , Khalfan-Jagani, Z и Jackson, D (2002) Межклеточный трафик слияния зеленого флуоресцентного белка KNOTTED1 в меристеме листа и побега Arabidopsis .Proc Natl Acad Sci U S A 99: 4103-8.

Мишель Хек — Институт Бойса Томпсона

Разработка Citrus medica, инфицированная Candidatus Liberibacter asiaticus, оказывает специфическое и неспецифическое воздействие на половую принадлежность и взрослые особи Diaphorina citri и ее эндосимбионтов

2020.

Коутс, Л.С., Махони, Дж., Рэмси, Дж. С., Уорвик, Э., Джонсон, Р., Маккосс, М. Дж., Краснофф, С. Б., Хо…

Протеомика в немодельных организмах: новый аналитический рубеж.

2020.

Хек, Мишель Л., Нили Б.А.

РНК-аптамерный захват макромолекулярных комплексов для масс-спектрометрического анализа

2020.

Рэй, Дж., Круз, А., Озер, А., Каджитани, Т., Джонсон, Р., Маккосс, М., Хек, Мишель Л., Лис, Дж. Т.

Продольный транскриптомный, протеомный и метаболомный анализ реакции Citrus limon на прививку трансплантата « Candidatus Liberibacter asiaticus ».

2020.

Рэмси, Дж. С., Чин, Э. Л., Чавес, Дж. Д., Саха, С., Мищук, Д., Махони, Дж., Мор, Дж., Робисон, Ф. М.,…

Пептидомические подходы к идентификации биоактивных молекул из Diaphorina citri

2020.

Fleites, L.A., Johnson, R., Kruse, A.R., Nachman, R.J., Hall, D.G., MacCoss, M.J., Heck, Michelle L.

Сидерофоры энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana

2020.

Краснофф, С.Б., Хау, К.Дж., Хек, Мишель Л., Донзелли, Б.Г.Г.

J. Nat. Прод ..

296–304

Продольный транскриптомный, протеомный и метаболомный анализ Citrus sinensis (L.) Osbeck, привитого «Candidatus Liberibacter asiaticus».

2019.

Чин, E.L., Ramsey, J.S., Mishchuk, D.O., Saha, S., Foster, E., Chavez, J.D., Howe, K., Zhong, X., П…

Полеровирус, вирус скручивания листьев картофеля, изменяет взаимодействия между растениями и переносчиками с помощью трех вирусных белков

2019.

Паттон, М.Ф., Бак, А., Сэйр, Дж., Хек, Мишель Л., Кастил К.Л.

Оценка пригодности базы данных последовательностей белков с помощью секвенирования de novo.

2019.

Джонсон, Р., Сирл, Британская Колумбия, Нанн, Б.Л., Гилмор, Дж. М., Филлипс, М., Амемия, К. Т., Хек, Мишель Л.…

Протеомика клеток Mol..

198–208

Уроки от одной необычной бактерии к другой: что мы можем узнать о видах Liberibacter от Xylella fastidiosa

2019.

Kruse, A., Fleites, L.A., Heck, Michelle L.

Распространение и изменчивость бактериального эндосимбионта и титра Candidatus Liberibacter asiaticus в переносчике насекомых Хуанлунбин, Diaphorina citri Kuwayama.

2019.

Хоссейнзаде, С., Шамс-Бахш, М., Манн, М., Фаттах-Хоссейни, С., Багери, А., Мехрабади, М., Хек, Миче…

Идентичность единственного остатка РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса грейпвайн Фанлиф, модулирующего очищение вен у Nicotiana benthamiana

2019.

Osterbaan, L.J., Choi, J., Kenney, J., Flasco, M., Vigne, E., Schmitt-Keichinger, C., Rebelo, A.R.,…

Молекулярные взаимодействия растений и микробов.

790–801

Взгляд сквозь призму технологий Omics: понимание передачи растительных вирусов, передаваемых насекомыми

2019.

Уилсон, Дж. Р., ДеБласио, С. Л., Александр, М. М., Хек, Мишель Л.

Актуальные проблемы молекулярной биологии.

113–144

Вирусы растений, передаваемые двумя разными способами, по-разному влияют на небольшие РНК-опосредованные процессы в своем векторе тли

2019.

Пиньейро, П.В., Уилсон, Дж. Р., Сюй, Ю., Чжэн, Ю., Ребело, А. Р., Фаттах-Хоссейни, С., Круз, А., Санто…

Морфология цвета Diaphorina citri влияет на взаимодействие с его бактериальными эндосимбионтами и Candidatus Liberibacter asiaticus

2019.

Хоссейнзаде, С., Рэмси, Дж., Манн, М., Беннет, Л., Хантер, В. Б., Шамс-Бахш, М., Холл, Д. Г., Хек, Мишель…

Candidatus Liberibacter asiaticus минимально изменяет экспрессию белков иммунитета и метаболизма в гемолимфе Diaphorina citri, насекомых-переносчиках Huanglongbing

2018.

Круз, А., Рэмси, Дж.С., Джонсон, Р., Холл, Д.Г., Маккосс, М.Дж., Хек, Мишель Л.

Журнал протеомных исследований.

2995–3011

Целенаправленное прекращение передачи тлей: видение борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур, вызываемыми представителями Luteoviridae

2018.

Heck, Michelle L., Brault, V.

Текущее мнение в области вирусологии.

24–32

Распространение и изменчивость бактериального эндосимбионта и титра Candidatus Liberibacter asiaticus в переносчике насекомых Хуанлунбин, Diaphorina citri Kuwayama

2018.

Хоссейнзаде, С., Шамс-Бахш, М., Манн, М., Фаттах-Хоссейни, С., Багери, А., Мехрабади, М., Хек, Миче…

Динамика взаимодействия двух белков движения вируса листовой скрутки картофеля влияет на их локализацию на внешних мембранах митохондрий и пластидов

2018.

ДеБласио, С.Г., Сюй, Ю., Джонсон, Р.С., Ребело, А.Р., Маккосс, М.Дж., Грей, С.М., и Хек, Мишель Л.…

Нарушение функции хлоропластов из-за подавления активности фитоиндесатуразы усиливает системное накопление передаваемого тлями и ограниченного флоэмами вируса

2018.

ДеБласио, С. Л., Ребело, А. Р., Паркс, К., Грей, С., Хек, Мишель Л.

Молекулярные взаимодействия растений и микробов.

Оптогенетическая стимуляция фосфоинозитидов показывает критическую роль первичных ресничек в регуляции глазного давления.

Abstract

Глаукома — это группа прогрессирующих оптических невропатий, которые вызывают необратимую потерю зрения.Хотя повышенное внутриглазное давление (ВГД) связано с развитием и прогрессированием глаукомы, механизмы его регуляции до конца не изучены. Здесь мы разработали оптогенетические конструкции на основе CIBN / CRY2 для изучения регуляции фосфоинозитидов в отдельных субклеточных компартментах. Мы показываем, что стимуляция CRY2-OCRL, инозитол-5-фосфатазы, увеличивает отток водянистой влаги и снижает ВГД in vivo, что вызвано зависимой от кальция перестройкой актина в клетках трабекулярной сети.Стимуляция фосфоинозитидами также восстанавливает дефектный отток воды и ВГД на модели мышей с синдромом Лоу, но не у мышей IFT88 ^{fl / fl}, у которых отсутствуют функциональные реснички. Таким образом, наше исследование является первым, в котором используется оптогенетика для регулирования глазного давления и демонстрируется, что жесткая регуляция фосфоинозитидов имеет решающее значение для гомеостаза водянистой влаги как в нормальных, так и в больных глазах.

ВВЕДЕНИЕ

Глаукома — это группа нейродегенеративных заболеваний зрительного нерва и основная причина необратимой слепоты.При всех формах глаукомы потеря ганглиозных клеток сетчатки (RGC) приводит к необратимой потере зрения ( 1 ). Снижение внутриглазного давления (ВГД) в настоящее время является единственным эффективным методом лечения глаукомы как у детей, так и у взрослых. Определение основных механизмов регуляции ВГД имеет решающее значение для понимания патогенеза глаукомы.

Регуляция ВГД включает широкий спектр различных сигнальных молекул, которые прямо или косвенно контролируют сопротивление оттоку водянистой влаги ( 2 ).Все больше данных указывает на то, что внеклеточный матрикс и актиновый цитоскелет в трабекулярной сети (TM) играют критическую роль в модуляции оттока ( 3 , 4 ). Клетки TM — это специализированные клетки, которые происходят из нервного гребня и расположены в иридокорнеальном углу глаза. Поскольку водянистая влага вырабатывается цилиарным телом глаза и в основном выводится через канал оттока ТМ, дефекты в этой области вызывают накопление водянистой влаги и последующее повышение ВГД ( 5 — 7 ).

Первичные реснички — это консервативные одиночные органеллы, которые являются важными механо- или хемосенсорами в ряде систем органов, включая мозг, почки и кости ( 8 , 9 ). Цилиарная передача сигналов может активировать внутриклеточные пути, которые контролируют клеточный гомеостаз и восстановление ( 10 ). Первичные реснички, следовательно, могут действовать как гомеостатические сенсоры в TM клетках, и необходима тонкая настройка их передачи сигналов для установления базальных уровней ВГД. Первичные реснички были обнаружены в клетках TM у людей и грызунов, что указывает на консервативную роль у разных видов ( 11 ).

Окулоцереброренальный синдром Лоу (синдром Лоу) — редкое Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное мутацией в гене OCRL1 , который кодирует полифосфат-5-фосфатазу инозитола ( 12 ). Помимо дефектов мозга и почек, у пациентов Lowe часто развивается повышенное ВГД и врожденная глаукома ( 13 ). Наша предыдущая работа показала, что OCRL локализован в первичных ресничках TM человека (HTM) ( 11 ) и что фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат [PI (4,5) P ₂] увеличивается в клетках, полученных из у пациентов с синдромом Лоу и в клетках с дефицитом OCRL, что позволяет предположить, что OCRL вносит важный вклад в регуляцию цилиарного фосфоинозитида ( 11 ).Фосфоинозитиды регулируют различные клеточные процессы, включая актиновый цитоскелет, миграцию клеток и перенос ионов через мембраны. Таким образом, мы предположили, что субклеточная активация фосфоинозитидов может изменять скорость оттока воды и ВГД.

Чтобы исследовать, вносит ли регуляция фосфоинозитида в плазматическую мембрану или первичные реснички вклад в отток водянистой влаги, мы модифицировали оптогенетическую систему рекрутирования белков на основе двух растительных белков, криптохрома 2 (CRY2) и фактора транскрипции CIBN.Первоначально описано Idevall-Hagren et al. ( 14 ), домен OCRL (5-птаза _OCRL), который дефосфорилирует 5-положение инозитольного кольца PI (4,5) P ₂ и PI (3,4,5) P ₃ (фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат) слит с доменом области гомологии фотолиазы CRY2, в то время как CIBN слит с нацеливающими сигналами для различных клеточных компартментов. Здесь мы сначала показываем, что освещение синим светом клеток млекопитающих, экспрессирующих оптогенетические конструкции, имеет различные эффекты на актиновый цитоскелет, которые зависят от целевой последовательности для субклеточного перераспределения фосфоинозитидов.Затем мы показываем, что оптогенетическая стимуляция 5-птазы _OCRL может увеличить способность оттока воды на мышиных моделях глаукомы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Индуцируемое светом рекрутирование CRY2-5-ptase

_OCRL на плазматическую мембрану и первичные реснички in vitro

Чтобы определить, влияет ли субкомпартментное распределение OCRL на отток воды, мы сначала использовали, а затем модифицировали светоиндуцируемую систему. описанный Idevall-Hagren et al. ( 14 ).Чтобы проанализировать эффективность этой системы в клетках hRPE глаза (пигментный эпителий сетчатки человека) и HTM-клетках, мы исследовали эффективность транслокации CRY2-OCRL на плазматическую мембрану. Для этого анализа 5-птазный домен OCRL, слитый с оптогенетическим CRY2, направляется через свет в зависимости от времени / местоположения к его димеризующему партнеру CIBN, который нацелен на субклеточный компартмент внутри клетки (рис. 1A). Мы подтвердили, что клетки hRPE и HTM экспрессируют трансфецированный красный флуоресцентный mCherry (mCh – CRY2–5-ptase _OCRL) и гибридный белок CIBN-EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) с доменом CAAX-box для нацеливания на плазматическую мембрану (CIBN- EGFP-CAAX).Перед стимуляцией синим светом (темнота) конфокальная микроскопия выявила цитозольное накопление mCh – CRY2–5-ptase _OCRL. Экспрессия CIBN-EGFP-CAAX была увеличена на плазматической мембране с разбросанными цитозольными агрегатами. Индукция димеризации CRY2-CIBN синим возбуждением приводит к накоплению mCh-CRY2-5-ptase _OCRL на плазматической мембране как в клетках hRPE, так и в HTM (рис. S1A). График интенсивности mCh – CRY2–5-ptase _OCRL для периферической области светостимулированных клеток hRPE показывает, что ответ на синий свет и привлечение к плазматической мембране были почти мгновенными и совпадали с умеренным снижением цитозольного mCh– CRY2–5-птаза _OCRL.График интенсивности показывает постепенное обращение mCh – CRY2–5-ptase _OCRL, при этом уровни возвращаются к исходному уровню после 10-минутного инкубационного периода в темноте (рис. 1B).

Рис. 1 Оптогенетическая модуляция OCRL в субклеточных компартментах.

( A ) Схематическая модель оптогенетического рекрутирования mCh-CRY2-5-ptase _OCRL на плазматическую мембрану или первичные реснички после активации синим светом. Активация синего света вызывает рекрутирование цитозольной mCh – CRY2–5-ptase _OCRL к своему партнеру по димеризации EGFP-CIBN, который может быть нацелен на субклеточные компартменты.( B ) Конфокальные изображения периферической области клеток hRPE. Клетки, экспрессирующие mCh – CRY2–5-ptase _OCRL и CIBN-EGFP-CAAX, были проанализированы с помощью Z-стека для мониторинга накопления mCh – CRY2–5-ptase _OCRL до и с интервалами 10 мин после освещения 20 × 300 –Ms импульсов синего света и построен соответствующий график данных интенсивности mCh – CRY2–5-ptase _OCRL ( N = 6). A.U., условные единицы. ( C ) Типичные изображения конструкций CIBN-EGFP с целевыми доменами в реснички.Клетки RPE трансфицировали конструкциями, направленными на реснички CIBN-EGFP- (VAPA / SSTR3), а затем фиксировали и окрашивали цилиарным маркером (ARL13b). ( D ) Репрезентативные изображения оптогенетического рекрутирования mCh – CRY2–5-ptase _OCRL на конструкции CIBN, нацеленные на реснички, VAPA и SSTR3, и контроль ядер CIBN (NLS). ( E ) Конфокальные изображения клеток HTM, экспрессирующих mCh – CRY2–5-ptase _{, OCRL} и CIBN-EGFP-SSTR3. Накопление mCh – CRY2–5-ptase _OCRL в цилиарной области измерялось до и с интервалами 10 мин после облучения импульсами синего света 20 × 300 мс и соответствующими данными об интенсивности mCh – CRY2–5-ptase _OCRL. построен график ( N = 6).

На основе нашей предыдущей работы, показывающей аномальное увеличение цилиарного PI (4,5) P ₂ в клетках пациентов Лоу ( 15 ), мы решили модифицировать наши оптогенетические конструкции для специфического воздействия на CRY2-5-птазу. _OCRL к первичной ресничке и изучить его функциональную роль в модуляции уровней фосфоинозитидов. Мы заменили CAAX-бокс в CIBN-EGFP-CAAX на целевую последовательность цилиарного родопсина человека (CTS) (обозначенную как VAPA). Другая конструкция для нацеливания на реснички была создана путем замены домена CAAX-бокса на CTS, обнаруженную в третьей внутриклеточной петле G-белка (гетеротримерный гуанин-нуклеотид-связывающий белок) — связанный рецептор соматостатинового рецептора 3 (SSTR3) ( 16 , 17 ).

Сначала мы проверили правильную локализацию этих нацеленных последовательностей в ожидаемом субклеточном компартменте. Конструкции CIBN-EGFP-VAPA или CIBN-EGFP-SSTR3 трансфицировали в клетки hRPE с последующим голоданием сыворотки для индукции образования первичных ресничек. Мы обнаружили отчетливое перекрытие флуоресцентного цилиарного CIBN EGFP с цилиарным маркером ARL13b (Fig. 1C). Затем мы использовали эти две новые CTS-содержащие конструкции в комбинации с mCh – CRY2–5-ptase _OCRL с последующей индукцией первичных ресничек путем голодания сыворотки.Положительные реснички CIBN-VAPA или CIBN-SSTR3 имели минимальные уровни накопления CRY2-5-ptase _OCRL в темноте. После активации димеризации CRY2-CIBN серией импульсов синего света (подробно описано в разделе «Материалы и методы») вдоль ствола ресничек было обнаружено неоднородное увеличение цилиарной CRY2-5-ptase _OCRL. Эти пятна различались по силе и расположению, что позволяет предположить, что движение CRY2-5-ptase _OCRL было более ограничено внутри аксонемы ресничек, чем в цитозоле (рис.1D). Кроме того, клиренс задерживался, и в некоторых случаях накопление CRY2-5-ptase _OCRL сохранялось в этих первичных ресничках через 10 мин (Fig. 1E). Этот результат указывает на то, что естественный транзит или клиренс белков из первичных ресничек может быть значительно замедлен в переходной зоне.

В качестве контроля мы также разработали CIBN с ядерным нацеливанием, чтобы оттеснить CRY2-5-ptase _OCRL от плазматической мембраны и мембраны ресничек. Последовательность ядерной локализации (NLS) была разработана для замены CAAX-бокса ( 18 , 19 ).С помощью этого подхода мы показали, что избирательная локализация CIBN в субклеточных компартментах приводит к успешной целевой доставке CRY2-5-ptase _OCRL (Fig. 1D). Как и ожидалось, привлечение ферментативной активности OCRL посредством световой активации к его мембранной мишени привело к локальному снижению уровней PI (4,5) P ₂ и превращению в фосфатидилинозитол-4-фосфат (PI4P) (рис. S1B). Мы ожидали, что эти изменения не только вызовут локальные изменения в организации цитоскелета и актина, но также, вероятно, повлияют на различные пути, участвующие в регуляции клеточного гомеостаза.

Вирусная трансдукция CRY2–5-птазы

_OCRL через нацеленный на мембрану / реснички CIBN-EGFP усиливает отток воды in vivo водного оттока, мы использовали два разных носителя для доставки в глаз: лентивирус и аденоассоциированный вирус (AAV). Обе оптогенетические конструкции (CIBN / CRY2) были созданы в лентивирусе и AAV (AAV2-s) и инъецированы в переднюю камеру глаза мышей C57BL / 6J дикого типа (WT).Инъекция вирусных конструкций, разведенных в Fast Green, вызвала отчетливую синюю окраску инъецированного глаза, обеспечивая дополнительное визуальное подтверждение соответствующей доставки вируса. Мечение EGFP продемонстрировало, что обе вирусные доставки привели к экспрессии генов CIBN на пути оттока TM. Введение наших оптогенетических конструкций с вектором на основе AAV2-s, продуцирующим in vivo трансдукцию TM-клеток и экспрессию CIBN / CRY2 на пути оттока TM после инкубационного периода продолжительностью от 3 до 4 недель (рис.2А). Через 4 недели один глаз каждой мыши в течение 10 минут освещался синим светом с помощью 450-нм, 10 мВт лазера, в то время как другой глаз оставался неосвещенным контролем с последующим измерением глазного давления с помощью тонометра.

Рис. 2 Измерение оттока оптогенетически обработанных мышей.

( A ) Схематический дизайн оптогенетических конструкций CRY2-5-ptase _OCRL и CIBN-EGFP были упакованы в AAV2-s или лентивирусные векторы и инъецированы в день 0 в переднюю камеру мышей C57BL / 6J WT.Глазную инъекцию визуализировали разбавлением синим красителем Fast Green. Переднюю камеру протыкали иглой 32-го размера по горизонтали, вводили воздух для создания небольшого пузырька воздуха и вводили 2 мкл вируса (> 10 ¹⁰ бляшкообразующих единиц). С 1 по 28 дни: вирусная экспрессия оптогенетических конструкций с лентивирусом или AAV2-s была разрешена в течение 4 недель, когда была достигнута положительная трансдукция клеток в переднем сегменте мыши, включая TM. Контроль носителя не проявлял флуоресценции.( B ) Схематическое изображение оптогенетической активации in vivo. Правый глаз каждого животного подвергали воздействию синего света мощностью 10 мВт (450-нм лазер) в течение 10 минут с последующим измерением оттока. ( C ) Графики перфузии глаза мыши, инъецированного AAV2-s – CIBN – EGFP – CAAX и CRY2–5-ptase _OCRL с воздействием синего света и без него. Глаза с освещением демонстрируют более высокую способность к оттоку, чем глаза без воздействия, что представлено значительной разницей между наклонами ( N = 10 глаз).( D ) Никаких существенных различий не наблюдалось в контрольных AAV2-s – CIBN – EGFP ( N = 10 глаз) или ( E ) конструкциях ядерного нацеливания AAV2-s – CIBN – NLS ( N = 8 глаз. ). ( F ) Измерение возможности оттока глаз, в которые вводили CIBN, нацеленный на реснички, через внутриглазную доставку AAV2, показывает значительное увеличение оттока ( N = 9 глаз). ( G ) Нацеливание на мембрану: снижение ВГД по сравнению с неосвещенными контрольными глазами ( H ).Нацеливание на реснички: снижение ВГД по сравнению с контрольными глазами без подсветки. Статистический анализ: парный образец t тест, где P <0,05 считалось статистически значимым. Планки погрешностей представляют SEM. ( I ) Репрезентативное отслеживание глазного давления у светостимулированных глаз мышей WT, обработанных AAV2-s – CIBN и CRY2–5-ptase _OCRL.

Затем из глаза удалили ядро и провели перфузию передней камеры для определения оттока воды (рис.2Б). Отток воды можно определить по соотношению притока жидкости к соответствующему глазному давлению. Эта процедура подробно описана в разделе «Материалы и методы» на репрезентативном примере из глаз дикого типа (рис. S2I). Когда ВГД отображается в зависимости от соответствующей стабильной скорости потока, наклон кривой представляет эффективность выхода водянистой влаги из глаза, также известного как средство оттока, которое может быть отображено в виде графиков.

Мыши, трансдуцированные CRY2-5-ptase _OCRL и CIBN-EGFP-CAAX, значительно увеличили возможность оттока в глазах, освещенных синим светом, по сравнению с контрольными глазами, которые не получали световой стимуляции (рис.2С). Чтобы подтвердить, что влияние на отток не было вызвано вторичным или вирусным эффектом, который был активирован освещением синим светом, мы выполнили освещение и перфузию синим светом у животных, которым вводили контрольный вектор AAV2-s – EGFP, и не наблюдали никаких различий с или без световой стимуляции (рис. 2D). Эти результаты подтверждают, что рекрутирование in vivo CRY2-5-ptase _OCRL на плазматическую мембрану было достаточным для увеличения возможности оттока.

Затем мы изучили in vivo эффект направления оптогенетической CRY2–5-ptase _OCRL в субклеточные компартменты внутри клетки.Конструкции субклеточного нацеливания для ресничек и ядер клонировали в векторы AAV2-s, и их эффективность трансдукции проверяли на глазах мышей. Чтобы проверить эффект ядерного нацеливания CRY2-5-ptase _OCRL, мышам вводили CRY2-5-ptase _OCRL и ядерное нацеливание AAV2-s. Измерения оттока при переменном постоянном давлении существенно не изменились в глазах, освещенных синим светом, по сравнению с неосвещенными контролями. Эти результаты показывают, что рекрутирование CRY2-5-ptase _OCRL в области клетки, удаленные от клеточной мембраны, не модулирует отток.Результаты дополнительно подтверждают, что ни оптогенетическое освещение, ни димеризация CRY2-CIBN сами по себе не влияют на модуляцию, наблюдаемую с конструкцией, направленной на мембрану (рис. 2E). Чтобы исследовать роль фосфоинозитидов внутри первичных ресничек в модуляции ВГД посредством OCRL, мы затем упаковали ранее сконструированные конструкции CIBN, нацеленные на реснички, в AAV2-s и лентивирус и ввели их CRY2-5-ptase _OCRL в переднюю камеру. Обе светоактивированные конструкции AAV2, нацеленные на реснички, значительно увеличили возможность оттока по сравнению с неосвещенными контролями (рис.2F и рис. S2D). Использование другой вирусной системы доставки (лентивирусная доставка) в качестве контроля дало аналогичные результаты (рис. S2C), которые подтверждают, что регуляция цилиарного фосфоинозитида имеет решающее значение для модуляции способности оттока. Показания тонометра, проведенные на мышах после воздействия синего света, показали значительное снижение ВГД в плазматической мембране или первичных ресничках CRY2–5-ptase _OCRL (рис. 2, G и H, и рис. S2, C и D). по сравнению с неосвещенными контролями, контролями EGFP и конструкциями для нацеливания на ядро (рис.S2, G и H). Мутант OCRL с мертвой фосфатазой не влиял на отток или ВГД (рис. S2, E и F). Эти результаты подтверждают, что эффекты на регуляцию оттока воды обусловлены ферментативным пространственным перераспределением функциональных OCRL к границам клеток, включая плазматическую мембрану и первичные реснички.

Модуляция фосфоинозитидов влияет на регуляцию кальция и цитоскелетный каркас TM-клеток

Мы предположили, что перестройка актинового цитоскелета из-за увеличения PI (4,5) P ₂ гидролиз и превращение в PI4P может объяснять снижение ВГД в светостимулированных глазах.Несколько групп показали, что регуляция актина изменяет отток воды ( 20 ). Чтобы определить роль CRY2-5-ptase _OCRL в модуляции актинового цитоскелета, мы котрансфицировали актиновый маркер LifeAct и оптогенетические конструкции CRY2-5-ptase _OCRL и CIBN-EGFP-CAAX в клетках hRPE и HTM. После световой стимуляции актиновые стрессовые волокна постепенно уменьшались, что совпало со значительным уменьшением размера клеток. Эти результаты предполагают, что распад PI (4,5) P ₂ на мембране влияет на организацию цитоскелета и пластичность клеток.Сокращение клеток было более выраженным в клетках HTM, чем в клетках hRPE (фиг. 3A). Тот же протокол световой активации не повлиял на размер клеток, которые не были трансфицированы CIBN-CAAX или которые были трансфицированы мертвым мутантом фосфатазы OCRL (D523G). Точно так же трансфекция контрольной конструкции для нацеливания на ядро CIBN-EGFP-NLS в сочетании с LifeAct и CRY2–5-ptase _OCRL не повлияла на организацию цитоскелета или размер клеток (рис. S3A). Конструкция, нацеленная на реснички, вызвала умеренное, но не значительное изменение размера клеток в HTM после первых 10 мин (рис.3А).

Рис. 3 Модуляция фосфоинозитидов влияет на регуляцию кальция и актиновый цитоскелет TM-клеток.

( A ) Репрезентативное изображение распределения актина LifeAct и CRY2–5-ptase _OCRL в клетках hRPE и HTM. После экспрессии конструкций CIBN и CRY2-5-ptase _OCRL клетки стимулировали серией импульсов света с длиной волны 488 нм и измеряли реорганизацию цитоскелета. Контур клеток был указан до и через 10-20 минут после набора CRY2-5-ptase _OCRL.Значительное уменьшение размера клеток параллельно сокращению внутреннего расположения актина было обнаружено в нацеленной на плазматическую мембрану CRY2-5-ptase _OCRL. ( B ) Анализ клеточного сокращения клеток HTM, трансфицированных CRY2–5-ptase _OCRL и CIBN-SSTR3 / CAAX, после освещения синим светом. ( C ) LifeAct actin CRY2–5-ptase _OCRL и клетки, трансфицированные CIBN-CAAX, предварительно обработанные BAPTA AM до и после оптогенетической активации синим светом. Показаны репрезентативное изображение и количественная оценка.( D ) График интенсивности флуоресценции BAPTA AM после оптогенетической активации синим светом. ( E ) Рекрутмент CRY2–5-ptase _OCRL на плазматическую мембрану с последующей 10-минутной инкубацией и окрашиванием фаллоидином при 4% фиксации параформальдегидом. Рекрутирование на плазматическую мембрану было связано с повышенной фрагментацией актиновых стрессовых волокон по сравнению с неактивированным светом контролем. Статистический анализ изменения размера клеток ( N = 6), где шесть размеров обработанных клеток сравнивали с размерами необработанных клеток, которые нормализованы к 1, непарный тест t , где P <0.05 считался статистически значимым. Планки погрешностей представляют SEM (* P ≤ 0,05 и ** P ≤ 0,01).

Затем мы изучили влияние оптогенетической регуляции на сокращение клеток с помощью анализа сокращения клеток на основе коллагена с использованием клеток HTM. Клетки HTM, обработанные моноксимом 3-бутандиона, вызывающим сокращение, в качестве положительного контроля продемонстрировали значительное сокращение. В клетках HTM, трансфицированных локализующейся на мембране CRY2–5-ptase _OCRL, значительное сокращение уже произошло через 10 мин после освещения синим светом (рис.3Б). Анализ локализующихся в ресничках OCRL показал, что хотя первоначально измерялось только умеренное сокращение, сокращение стало значительным в течение более длительного инкубационного периода. Возможно, что цитоскелетный эффект OCRL в первичных ресничках может дополнительно регулироваться и усиливаться потоком in vivo, что объясняет отсроченный или сниженный эффект in vitro. Известно, что сокращение клеток опосредуется внутриклеточным кальцием. Поскольку предыдущие исследования показали, что OCRL связывается с цилиарным временным рецептором потенциального ваниллоидного 4 (TRPV4) кальциевого канала, возможно, модулируя его активность ( 11 ), мы затем проверили, может ли модуляция внутриклеточного кальция влиять на сокращение.Мы обнаружили, что в клетках HTM внутриклеточный кальций, индуцированный агонистом TRPV4 (GSK1016790A) или тапсигаргином (ингибитор аденозинтрифосфатазы эндоплазматического ретикулума), вызывает разную степень сокращения клеток (рис. S3, B и C). Чтобы определить, было ли сокращение, вызванное локализацией CRY2-5-ptase _OCRL, кальций-зависимым, BAPTA AM использовали в качестве проницаемого для клеток хелатора кальция. Мы обнаружили, что предварительная обработка BAPTA AM с последующим оптогенетическим привлечением OCRL к плазматической мембране предотвращает сокращение клеток, наблюдаемое ранее (рис.3С). Внутриклеточная флуоресценция BAPTA AM увеличивалась при связывании и хелатировании кальция, и мы зарегистрировали значительное увеличение флуоресценции BAPTA AM вскоре после оптогенетического рекрутирования CRY2-5-ptase _OCRL на плазматическую мембрану, предполагая, что индуцированное светом рекрутирование увеличивало внутриклеточный кальций (рис. . 3D). Анализ перфузии глаз мышей, инъецированных агонистами или антагонистами TRPV4, показал различное влияние на способность оттока, что дополнительно подтверждает роль кальция в регуляции способности сокращения / оттока TM (рис.S3D). Было высказано предположение, что кальций вносит вклад в организацию актина цитоскелета несколько десятилетий назад ( 21 ). Чтобы детально изучить изменения цитоскелета, мы сравнили актиновый цитоскелет в неактивированных и светоактивированных CRY2–5-ptase _OCRL и клетках, трансфицированных CIBN-EGFP-CAAX. Оптогенетическая CRY2-5-ptase _OCRL, рекрутируемая на плазматическую мембрану, значительно снижает и фрагментирует линейные актиновые стрессовые волокна (Fig. 3E). Следовательно, мы заключаем, что изменение ВГД и оттока является результатом кальций-зависимой реорганизации актинового цитоскелета.

Модуляция OCRL на мышиной модели с синдромом Лоу

Предыдущий анализ окулоцереброренального синдрома Лоу показал, что OCRL играет решающую роль в его патогенезе, но подробных исследований на глазе мышей нет. Последние технические достижения теперь позволяют измерять глазное давление и отток воды у мыши ( 22 ). Ботвелл, и др., . ( 23 ) показали, что у мышей, дефицитных только по Ocrl ( Ocrl ^{— / —}), было мало аномалий, если они вообще были, в то время как у мышей, у которых отсутствовали как Ocrl , так и Inpp5b ( Ocrl ^{— / —}: Inpp5b ^{— / —}) умер на 9-й день эмбрионального развития.5. INPP5B, паралог OCRL, представляет собой еще одну инозитол-5-фосфатазу. Однако введение человеческого INPP5B мышам с двойным нокаутом ( Ocrl ^{— / —} Inpp5b ^{— / —} INPP5B ^{+ / +}, далее именуемое IOB мышью), вызвало почечные аномалии. наблюдается при синдроме Лоу. Этот результат побудил нас изучить глазной фенотип мышей IOB; мы обнаружили, что это похоже на глазную патологию при синдроме Лоу у человека. Дилатационное исследование глазного дна показало истончение сетчатки на изображениях сосудов как правого (OD), так и левого (OS) глаза мышей IOB (рис.4A), который также похож на фенотип человека (рис. 4B). Кроме того, плоские крепления и поперечные срезы сетчатки обеих линий последовательно показали заметное снижение количества ганглиозных клеток у мышей IOB (рис. 4, C и D).

Рис. 4. Модуляция OCRL на мышиной модели с синдромом Лоу.

( A ) Слева: визуализация сетчатки и оптическая когерентная томография правого (OD) и левого (OS) глаза мыши IOB. Справа: изображение сосудов мыши IOB с тяжелой катарактой.( B ) Изображения зрительного нерва пациентов с синдромом Лоу и глаукоматозным купированием зрительного нерва. ( C ) Плоское крепление и ( D ) поперечные срезы сетчатки нормальных мышей и мышей IOB, которые были окрашены маркером RGC, RBPMS и окрашиванием гематоксилином и эозином, соответственно. Заметное снижение уровня RGC и количества RGC обнаруживается у 4-месячных мышей IOB по сравнению с контролем WT того же возраста. IPL, внутренний плексиформный слой; INL, внутренний ядерный слой; OPL, внешний плексиформный слой; ONL, внешний ядерный слой.( E ) Средний отток перфузированных глаз у мышей IOB ^{— / —} ( N = 14) или мышей IOB ^{+ / Y} (контроль, N = 12) и сравнение, проведенное с непарными t тест. ( F ) Измерения ВГД с помощью тонометра TonoLab. Получены измерения ВГД мышей IOB ^{— / —} ( N = 10) по сравнению с мышами IOB ^{+ / Y} (контроль) ( N = 8), и сравнение было выполнено с непарным тестом t .( G ) Графики перфузии глаз модели IOB, инъецированных AAV2-s – CIBN – CAAX и mCh – CRY2–5-ptase _OCRL с воздействием синего света и без него. Глаза с освещением демонстрируют более высокий отток и более низкое ВГД, чем глаза без воздействия, что представлено значительной разницей между наклонами ( N = 4, сравнение между левым и правым глазом). Статистический анализ проводился с использованием парной выборки t test. ( H ) Графики перфузии глаз модели IOB, инъецированных AAV2-s – CIBN – SSTR3 и mCh – CRY2–5-ptase _OCRL с воздействием синего света и без него.Глаза с освещением демонстрируют более высокий отток и более низкое ВГД, чем глаза без воздействия, что представлено значительной разницей между наклонами ( N = 4, сравнение между левым и правым глазом). Статистический анализ проводился по парной выборке t test, где P <0,05 считалось статистически значимым. Планки погрешностей представляют SEM (* P ≤ 0,05 и ** P ≤ 0,01).

Затем мы исследовали глаз на наличие дефектов оттока воды, которые лежат в основе развития глаукомы.Исследование среднего оттока перфузированных глаз показало, что скорость оттока снижалась при разных уровнях ВГД у мышей IOB, чем у контрольных мышей IOB ^{+ / Y} (фиг. 4E). Измерение глазного давления с помощью тонометра отскока подтвердило аномально повышенное давление у мышей IOB по сравнению с IOB ^{+ / Y} (контроль) (фиг. 4F). Мы пришли к выводу, что нарушение оттока воды может лежать в основе глаукомного фенотипа, наблюдаемого у мышей IOB. Вместе эти данные показывают, что у мышей IOB наблюдаются дефекты глаза и сниженный отток воды, аналогично таковым у пациентов с синдромом Лоу.Эти дефекты могут быть напрямую связаны с известной модулирующей ролью OCRL в регуляции фосфоинозитидов и актина цитоскелета (рис. S4) ( 24 , 25 ). Эти данные привели нас к предположению, что аномальная регуляция фосфоинозитидов в глазу может привести к дефектам оттока воды.

Мы показали, что оптогенетическое рекрутирование CRY2-5-ptase _OCRL на плазматическую мембрану или первичные реснички может модулировать способность оттока. Чтобы определить, имеет ли рекрутинг CRY2-5-ptase _OCRL такой же положительный эффект при патологических состояниях, мы протестировали оптогенетическое рекрутирование плазматической мембраны и ресничек на мышиной модели синдрома Лоу IOB.Мышам IOB инъецировали AAV2-s – CRY2–5-ptase _OCRL и AAV2-s CIBN-EGFP-CAAX или AAV2-s CIBN-EGFP-SSTR3, и после 4-недельного инкубационного периода индуцировали оптогенетическую транслокацию с помощью синий свет, как описано ранее. Показания тонометра показали значительное снижение ВГД в оптогенетически стимулированном глазу по сравнению с нестимулированным глазом с конструкциями, направленными как на мембрану, так и на реснички. Анализ перфузии оттока соответствующих энуклеированных глаз подтвердил данные ВГД (рис.4, G и H), предполагая, что ВГД снизилось с обеими оптогенетически активированными конструкциями из-за местного увеличения оттока воды через TM.

PI (4,5) P

₂ и первичные реснички играют критическую роль в регуляции оттока

Чтобы определить, требуется ли ферментативная активность 5-фосфатазы для регуляции оттока, мы заблокировали активность OCRL, введя селективный ингибитор против OCRL1. (YU142670) в переднюю камеру глаза. После 30-минутного инкубационного периода мы провели анализ перфузии обработанных и необработанных контрольных глаз, который показал, что фармакологическое ингибирование заметно снижает возможность оттока (рис.5А). Дефицит OCRL ранее был связан с аномальным увеличением внутриклеточных уровней PI (4,5) P ₂. PI (4,5) P ₂ — известный регулятор полимеризации актина. Для дальнейшего подтверждения того, что уменьшение возможности оттока за счет OCRL было в первую очередь связано с аномальным накоплением PI (4,5) P ₂, а не с изменениями других метаболитов, таких как PI4P или PI (3,4,5) P ₃, мы применили два дополнительных фармакологических регулятора PI (4,5) P ₂, которые контролируют превращение PI (4,5) P ₂ в PI (3,4,5) P ₃ (рис.5Б). Анализ перфузии показал, что ингибирование фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) значительно снижает возможность оттока, тогда как активация PI3K вызывает умеренное увеличение (фиг. 5C). Хотя эти результаты не исключают, что изменения PI4P или PI (3,4,5) P ₃ выше или ниже по потоку также могут влиять на возможность оттока, они показывают, что различные ферментативные манипуляции, которые снижают PI (4,5) P ₂ уровней достаточны, чтобы оказать положительное влияние на отток и ВГД (рис.5, В и Г).

Рис. 5 Фосфоинозитиды и первичные реснички регулируют отток воды.

( A ) Передние камеры глаз мышей WT инъецировали 100 мкМ (YU142670) ингибитора OCRL, и анализ перфузии выполняли после 30-минутной инкубации. Анализ перфузии родственных необработанных контрольных мышей проводили в тех же условиях, и сравнение оттока показано в виде усовидного графика оттока C для YU142670. ( B ) Схематическое изображение мишеней для лекарств.( C ) Графики перфузии передней камеры глаза инъецировали 1 мкл 10 мкМ ингибитора PI3K (GSK1059615) или 50 мкМ активатора PI3K (740-Y-P) на глаз. ( D ) Анализ тонометром глазного давления мышей, обработанных GSK1059615 и 740-Y-P, после 2-часовой инкубации. ( E ) Анализ мышей IFT88 ^{fl / fl}, которым внутриглазно инъецировали лентивирус CRE для удаления первичных ресничек в комбинации с AAV2-s – CRY2 – OCRL + AAV2-s – CIBN – CAAX / SSTR3. ( F ) Соответствующий график усов оттока C для глаз IFT88 ^{fl / fl} / CRE, подвергнутых оптогенетической обработке (синие точки, свет активирован) ( N = 4 глаза).Статистический анализ проводился по независимым выборкам t тест и парный t тест, где P <0,05 считалось статистически значимым. Планки погрешностей представляют SEM. ( G ) Схематическое изображение зависимой от 5-ptase _OCRL оптогенетической модуляции ВГД в TM глаза мыши. (* P ≤ 0,05 и ** P ≤ 0,01).

Чтобы выяснить, играет ли OCRL-зависимая регуляция PI (4,5) P ₂ в первичных ресничках или плазматической мембране взаимную или независимую роль в модулировании оттока, мы затем провели анализ перфузии на мышах IFT88 ^{fl / fl} которые получили лентивирусную инъекцию CRE в переднюю камеру, чтобы устранить способность TM-клеток образовывать первичные реснички (рис.5E и рис. S5). Мы не измерили никакой разницы в способности оттока между мышами IFT88 ^{fl / fl}, которым вводили только CRE, и мышами IFT88 ^{fl / fl}, коинфицированными CRE и либо AAV2-s – CRY2 – OCRL + AAV2-s – CIBN – CAAX, или SSTR3, но без световой стимуляции. После световой активации инъекция только нацеленных на плазматическую мембрану AAV2-s значительно увеличивает возможность оттока, тогда как инъекция нацеленных на реснички AAV2-s не оказывает никакого эффекта (Fig. 5F). Эти результаты показывают, что действие CRY2-5-птазы _OCRL на плазматическую мембрану не зависит от первичных ресничек, тогда как в модели с удаленными ресничками CRY2-5-птаза _OCRL неспособна оказывать или инициировать свое положительное влияние на отток объекта.Анализ ВГД подтверждает этот вывод (рис. S5B). Используя оптогенетическую модель, мы показываем, что функциональные первичные реснички играют ключевую роль в регуляции фосфоинозитола и адаптивной модуляции ВГД в здоровом глазу.

ОБСУЖДЕНИЕ

Передача сигналов фосфоинозитидов вовлечена в широкий спектр биологических процессов. В этом исследовании мы приводим доказательства новой роли фосфоинозитидов в регуляции глазного давления. Мы использовали in vivo оптогенетическую стимуляцию взаимодействия CRY2-CIBN, чтобы показать, что субклеточное нацеливание инозитолфосфатазы OCRL в глаз мыши может по-разному регулировать отток воды и ВГД.Мы также представляем доказательства того, что лежащий в основе механизм основан на кальций-зависимой перестройке цитоскелета актина и регуляции первичных ресничек в TM клетках, которые вызывают сокращение клеток, усиление оттока воды и снижение IOP (Fig. 5G). Это первое исследование, в котором оптогенетика используется для изучения глазного давления. Прямое воздействие синего света с длиной волны 450 нм проникает в глаз и освещает его, что активирует димеризацию CRY2-CIBN in vivo. Предыдущие исследования возможности оттока полагались в основном либо на фармакологические, либо на генетические манипуляции (нокдаун и сверхэкспрессия) на животных.Использование системы CIBN / CRY2 позволило нам продемонстрировать прямое влияние активации фермента (OCRL) на отток in vivo.

Важным прорывом в этом исследовании стало открытие, что фосфоинозитиды в клетках TM могут регулировать глазное давление. Основная ферментативная активность 5-фосфатазного домена OCRL (CRY2–5-ptase _OCRL) направлена на PI (4,5) P ₂ ( 26 ). OCRL и INPP5B — единственные известные в настоящее время варианты фосфатаз, которые участвуют в дефосфорилировании PI (4,5) P ₂ до PI4P на апикальной поверхности ( 23 , 27 , 28 ).Роль различных каналов и подтипов рецепторов, на которые могут влиять регулируемые липидами перекрестные помехи, неизвестна ( 29 , 30 ). Доступные данные подтверждают особую роль OCRL в деградации PI (4,5) P ₂ и PI (3,4,5) P ₃, что вызывает изменения цитоскелета, влияющие на способность оттока и снижение ВГД. Изменения морфологии клеток и сокращение клеток в первую очередь управляются актиновым цитоскелетом, и мы показали, что привлечение инозитол-5-фосфатазы к плазматической мембране может реорганизовать цитоскелет.Это открытие согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что TM имеет свойства, подобные гладким мышцам, и множество рецепторов и каналов гладких мышц, которые регулируют актин и играют важную роль в сократимости ( 31 , 32 , 33 ). Более того, было показано, что ТМ-клетки в бычьих глазах могут быть фармакологически индуцированы сокращением до такой степени, чтобы уменьшить отток, и что это сокращение было связано с повышением внутриклеточного кальция ( 31 ).

Мы показали, что регуляция кальция индуцирует сокращение TM в той же степени, что и оптогенетическое рекрутирование CRY2-5-ptase _OCRL, подтверждая, что сокращение, индуцированное OCRL, может быть опосредовано регуляцией внутриклеточного кальция. В поддержку этого предположения предыдущие исследования в нашей лаборатории показали функциональное взаимодействие между OCRL и кальциевым каналом TRPV4, предполагая, что OCRL может напрямую модулировать его функцию ( 11 ). Следовательно, регуляция фосфоинозитидов ресничек или плазматической мембраны может иметь решающее влияние на различные активности кальциевых каналов.Мы показываем, что блокирование внутриклеточного кальциевого пути может предотвратить сокращение клеток, вызываемое светостимулированной CRY2-5-ptase _OCRL, что дает убедительные доказательства того, что сокращение клеток, производимое CRY2-5-ptase _OCRL, зависит от кальция.

Примечательно, что наши данные подтверждают более ранние сообщения о том, что модуляция определенных пулов внутриклеточного PI (4,5) P _2,, участвующих в регуляции актина, может влиять на реорганизацию цитоскелета, которая, наоборот, является известным регулятором цилиогенеза ( 24 ).Предыдущие исследования показали, что ряд различных типов клеток с нокдауном OCRL1 характеризуется пониженной способностью собирать первичные реснички и уменьшением общей длины их ресничек ( 34 ), что позволяет предположить, что дефицит OCRL может препятствовать нормальному образованию первичных ресничек и функционируют через дефектную организацию актина.

Результаты этого исследования подтверждают модель, в которой аномальное накопление PI (4,5) P ₂ в различных областях клеток с дефицитом OCRL вызывает локальную дезорганизацию актина и, следовательно, нарушение нормальной клеточной функции, включая регуляцию первичных ресничек и пластичность клеток.Наши данные подтверждают, что уровни PI (4,5) P ₂ д. Строго регулироваться в двух критических областях, чтобы положительно влиять на ВГД: плазматическая мембрана и первичная ресничка. Оба сайта, вероятно, сходятся в общем перекрестном пути, который регулирует производную организацию цитоскелета и накопление актина, что обеспечивает сопротивление дальнейшей деформации под действием внешнего давления. Важность, которую наши результаты придают ресничкам, согласуется с четкими связями, установленными между 5-ptases, такими как INPP5E и OCRL1, и различными типами цилиопатий, включая синдромы Joubert / MORM (умственная отсталость, туловищное ожирение, дистрофия сетчатки и микропенис) и Синдром Лоу.Мы показываем, что присутствие функциональных первичных ресничек важно для нормального функционирования TM и что фосфоинозитиды играют критическую роль в синтезе различных механизмов, участвующих в регуляции оттока воды.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты

Мышиные антитела против ARL13b были приобретены в центре NeuroMab Университета Калифорнии в Дэвисе / Национальном институте здравоохранения (NIH) (Дэвис, Калифорния). Вторичные антитела козьего антитела против мышиного иммуноглобулина G Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594 были получены от Life Technologies.Alexa Fluor 568 Phalloidin и ProLong Gold Antifade Mountant с DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) были приобретены в Invitrogen. Ингибитор OCRL YU142670 (изготовленный на заказ) и ингибитор ROCK Y-27632 дигидрохлорид были от Tocris. Антитела морских свинок против RBPMS (РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом) (1832-RBPMS), антитела против PI4P (Z-P004) и PI (4,5) P ₂ (Z-P045) были получены от PhosphoSolutions (Аврора, Колорадо) и Эшелон (Солт-Лейк-Сити, Юта). Латрункулин B, Oregon Green 488, BAPTA-1, AM (A1076) и тапсигаргин (T9033) были получены от Sigma-Aldrich.Антифибронектин был приобретен у Abcam (ab2413). GSK1059615 [3,33 мг / мл в диметилсульфоксиде (ДМСО)], 740-YP (1 мг / мл в воде), GSK1016790A (10 мг / мл в ДМСО) и агонист TRPV4 HC 067047 (10 мг / мл в ДМСО). куплен у токриса.

Животные

Все эксперименты на животных следовали рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявления об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Медицинской школы Стэнфордского университета.Мыши WT (C57BL / 6) были приобретены в лаборатории Джексона. Ocrl ^{— / —} Inpp5b ^{— / —} INPP5B ^{+ / +} мышей были подарком Р. Л. Нуссбаума (Калифорнийский университет, Сан-Франциско). Мыши IFT88 ^{fl / fl} (B6.129P2-Ift88tm1Bky / J) были получены из лаборатории Джексона. Животных содержали при цикле 12 часов света / 12 часов темноты со свободным доступом к воде и пище. Для вирусных инъекций мышей анестезировали кетамином в зависимости от их массы тела [кетамин (100 мг / кг)].Для воздействия синего света и показаний тонометра мышей анестезировали изофлураном. Поток кислорода был установлен на 2 л / мин, а изофлуран — на 1% под носовым конусом. Все исследованные мыши были в одном возрастном диапазоне, чтобы избежать возрастной изменчивости.

Культура клеток

Контрольные культуры фибробластов человека (NHF558), культуры клеток hRPE человека и клеточные линии фибробластов Lowe 1676 были описаны ранее ( 35 ). Клетки HTM получали из роговицы трупа (Indiana Lions Eye Bank), а протоколы характеризации и культивирования основывались на предыдущих отчетах ( 36 , 37 ).В экспериментах, требующих цилиогенеза, применяли специфические условия культивирования для обеспечения образования первичных ресничек ( 10 ).

ДНК-плазмида и трансфекция

CIBN-EGFP-CAAX и mCh-CRY2-OCRL были подарками от P. de Camilli (Йельский университет). mRhodopsin CTS (³¹² KQFRNCMLTTL-CCGKNPLGDDDASATASKTETSQVAPA ³⁴⁸) был клонирован для получения CIBN-VAPA-EGFP. SSTR3 CTS из pEGFPN3-Sstr3 ( 16 ) клонировали для получения CIBN-EGFP-SSTR3. SV40 NLS (¹²⁴ PPKKKRKVA ¹³³) был клонирован для создания CIBN-EGFP-NLS.Оптогенетические конструкции были либо напрямую трансфицированы с использованием Lipofectamine 3000 (Invitrogen) или полиэтиленимин (Sigma), либо субклонированы отдельно в лентивирусные конструкции, меченные Flag и Myc, и AAV2-s tdTomato – LifeAct-7 и LV-Cre были от Addgene.

Иммунофлуоресценция

Срезы клеток в культуре обрабатывали синим лазером с длиной волны 488 нм в течение 10 минут перед фиксацией 4% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре с последующей пермеабилизацией 0,5% Triton X-100. Затем образцы блокировали фосфатно-солевым буфером (PBS) / 0.5% бычий сывороточный альбумин (BSA) / 10% нормальная козья сыворотка в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела применяли при 4 ° C в течение ночи, а затем вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 часа.

Конфокальная микроскопия и визуализация живых клеток

Визуализацию проводили с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM880 и инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer 5. Изображения Z-stack были выполнены с помощью конфокального микроскопа; активация одиночного импульса канала 488 нм (для CIBN-EGFP) сопровождалась сканированием временного ряда Z-стека канала 568 нм (для mCh-CRY) в течение не менее 10 мин.Интенсивность mCh-CRY2-OCRL в различных экспериментах количественно оценивали с помощью ImageJ (v1.47v, NIH). Площадь и общая интенсивность флуоресценции были измерены в выбранной области вокруг интересующей области.

Внутриглазная инъекция

Внутриглазная инъекция выполнялась согласно Wang et al. ( 38 ). Вкратце, AAV2-s или лентивирус с оптогенетическими конструкциями вводили в переднюю камеру глаза мышей C57BL / 6, анестезированных кетамином (100 мг / кг) в ddH ₂ O.Кроме того, в каждый глаз в качестве местного анестетика наносили по одной капле 0,5% гидрохлорида пропаракаина (Bausch & Lomb, Тампа, Флорида). Роговица была проколота стерильной иглой 33-го размера (STERiJECT) под наблюдением через диссекционный микроскоп (Nikon) для создания небольшого отверстия в передней камере. Иглу удаляли, и тонкий капилляр из боросиликатного стекла (World Precision Instruments, 1B150-4), соединенный со шприцем Гамильтона полиэтиленовой трубкой, пропускали через то же отверстие для введения небольшого пузырька воздуха.Капилляр медленно удаляли и заполняли 2 мкл вирусных конструкций (10 ¹⁰ инфекционных единиц / мкл), разбавленных синим красителем Fast Green, чтобы облегчить и контролировать инъекцию через то же место прокола. После введения разведенного вируса передняя камера была заполнена отчетливым синим оттенком, а стеклянный капилляр оставался на месте еще на одну минуту для отслеживания картины окрашивания. Затем воздушный пузырь осторожно перемещали к месту введения, чтобы закрыть прокол и предотвратить утечку вектора.После процедуры на каждый глаз наносили неомицин для предотвращения инфекции.

Измерение ВГД

ВГД измеряли с помощью тонометра TonoLab TV02; мыши получали местную анестезию. Устройство зафиксировало шесть достоверных измерений отскока от глаза; среднее значение пяти средних значений использовалось как одно итоговое измерение.

Аппарат перфузии глаза мыши

Аппарат перфузии глаза мыши был разработан в соответствии с предыдущими исследованиями ( 22 , 39 ).Как показано на схематическом изображении (рис. S2I), игла 33 калибра длиной 5 мм (TSK Laboratory, Япония), прикрепленная к микроманипулятору, была введена в переднюю камеру через роговицу под микроскопом, избегая повреждения радужки. и объектив. Игла была подсоединена к жесткой, неподходящей трубке Lectro-Cath, присоединенной к трехходовому крану, который был подсоединен на одной ступице к датчику MLT1199-BP (AD Instruments, CO), а на второй ступице — к калиброванному стеклянному Гамильтону. шприц с приводом от шприцевого насоса New Era (Syringe Pump, NY).Преобразователь MLT1199-BP был подключен к усилителю с помощью комплекта кабелей преобразователя (AD Instruments, CO). Насос (диапазон расхода от 0,001 мкл / час до 2120 мл / час) контролировался индивидуальным программным обеспечением для откачки, запрограммированным для интеграции с программным обеспечением LabChart 8 (AD Instruments, CO) в компьютере, подключенном к системе Amplifier / PowerLab (AD Instruments, CO). ). Модифицированное программное обеспечение контролировало расход перекачиваемой жидкости для поддержания стабильных настроек давления. Аппарат для перфузии был заполнен стерильным PBS Дульбекко и откалиброван перед каждым экспериментом.Перед канюляцией давление было нулевым. После канюляции давление в передней камере передавалось на датчик давления. Для достижения желаемого давления в передней камере использовалась высокая скорость потока; низкоскоростной поток контролировался шприцевым насосом и автоматически регулировался в соответствии с обратной связью между LabChart и программным обеспечением для перекачивания. Отток из передней камеры определялся и регистрировался в соответствии с низкоскоростным расходом, когда каждое давление достигало стабильного постоянного значения.В каждый глаз накачивали постоянное давление (значение Y ) от 10 до 35 мм рт. Типичные кривые перфузии показывают скорость потока (левая ось y красным цветом) и ВГД (правая ось y черным цветом) для глаза мыши WT в зависимости от времени. Каждая плоская запись скорости потока и давления была отмечена как постоянная скорость истечения при различных значениях ВГД.X1 и Y1 обозначают парное перфузионное давление и соответствующее ему ВГД (10, 15, 20, 25 мм рт. Ст.). Затем строили график зависимости ВГД от соответствующей стабильной скорости потока, где наклон указывает на обычное средство оттока, а точка пересечения х указывает на увеосклеральный отток, независимый от ВГД. Среднее значение оттока перфузированных глаз со скоростью потока (мл / мин) по оси y , нанесенное против ВГД (в мм рт. Ст.) На оси x , представляет собой график зависимости перфузии ВГД от скорости потока (рис.S2, A и B). Перед измерением с помощью этой системы мышей анестезировали и умерщвляли смещением шейных позвонков. Глазные яблоки были энуклеированы в течение 10 минут после смерти и немедленно перфузированы с помощью перфузионного аппарата. Мы перфузировали глаза в течение 60 минут с шагом ВГД. Чтобы определить возможность оттока для каждого образца, мы нарисовали зависимую взаимосвязь между ВГД и стандартной скоростью оттока ( C ), используя модифицированное уравнение Гольдмана: f = C × IOP + U .В этом уравнении f — низкоскоростной расход при каждом соответствующем стабильном ВГД, а U — нетрадиционный отток. Обычная скорость истечения C каждого образца была определена как наклон уравнения, построенного с использованием нескольких записанных скоростей откачки и соответствующих ВГД в GraphPad Prism.

Конструирование и получение вектора

AAV

AAV2 были мутированы по капсиду согласно Bogner et al. ( 40 ) (далее AAV2-s).Вирусные частицы AAV2 получали методом тройной плазмидной трансфекции в соответствии с протоколом Wang et al. ( 38 ). Вкратце, цис-, транс-AAV и вспомогательную плазмиду аденовируса (соотношение 2: 1: 1) трансфицировали с использованием реагента для трансфекции ДНК PolyJet In Vitro в клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293. Очистку вирусов проводили по протоколам Lock et al. ( 41 ). Затем вирусные частицы ресуспендировали в PBS. AAV2-s титровали с помощью количественной амплификации полимеразной цепной реакции TaqMan с использованием праймеров и зондов, обнаруживающих промотор и трансген кассеты трансгена с устойчивыми к дезоксирибонуклеазе I векторными геномными копиями в качестве эталона.Чистоту вирусных препаратов оценивали с помощью электрофореза в геле SDS – полиакриламидный гель.

Конструирование и производство лентивируса

Клетки HEK293TT культивировали и трансфицировали для получения лентивируса CIBN-EGFP и mCh-CRY2-OCRL или CRE в соответствии с адаптированными протоколами от Protocol Exchange ( 42 ). Вкратце, для создания использовали обратную трансфекцию. лентивирусных частиц. Трансфекцию проводят в суспендированных клетках 293T с использованием 20 мкг лентивирусного вектора, 10 мкг pVSV-G, 20 мкг pCMV-dR8.91 и 100 мкл PolyJet (SignaGen) или Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в 10-сантиметровых чашках. Комплекс плазмида / реагент для трансфекции и суспензия клеток 293Т смешивали в центрифужных пробирках объемом 50 мл и инкубировали в течение 30 мин на шейкере. Затем суспензию наносили на чашки размером 10 см. После 72-часового инкубационного периода вирус собирали и использовали концентратор Lenti-X (Clontech) для концентрирования вируса до желаемого небольшого объема. Концентрированный вирус (от 500 до 2000 мкл) использовали для заражения 1 × 10 ⁶ клеток в 500 мкл культуральной среды в присутствии полибрена (4 мкг / мл; Sigma-Aldrich) с последующим осторожным пипетированием 25 раз и встряхиванием для 10 мин в капюшоне.

Анализ сокращения клеток на основе коллагена

Сокращение клеток HTM после оптогенетической стимуляции выполняли с использованием анализа сокращения клеток на основе коллагена от Cell Biolabs, и эксперименты проводили в соответствии со спецификацией производителя. Вкратце, клетки HTM трансфицировали оптогенетическими конструкциями, и после инкубации в течение ночи клетки ресуспендировали и разводили в среде в концентрации от 2 × 10 ⁶ до 5 × 10 ⁶ клеток / мл. Затем суспензию клеток смешивали со смесью клеток и коллагена и высевали в 24-луночные планшеты.После инкубации в течение 1 часа при 37 ° C для полимеризации коллагена в каждую лунку добавляли 1,0 мл культуральной среды и инкубировали в течение 24 часов после оптогенетической стимуляции и измерения сокращения.

Статистический анализ

Весь статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad8 (Prism). Результаты выражены в виде средних значений ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием линейного регрессионного анализа для измерения возможностей оттока и непарного теста t для сравнения средних значений двух независимых групп, таких как отток и ВГД между контрольными мышами по сравнению с обработанными и больными мышами in vivo или культурами клеток, трансфицированными и обработанными разными соединения in vitro.

Парный тест t использовали для сравнения освещенных синим светом и неосвещенных глаз каждой мыши, трансдуцированной оптогенетическими вирусами, как указано. P <0,05 считалось статистически значимым. Четкие и четкие статистические результаты обычно обозначались звездочками (* P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 и *** P ≤ 0,001). Чтобы выделить статистические изменения, выходящие за пределы нормального диапазона, в некоторых случаях были указаны значения P .

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечное использование составляет , а не для коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

Благодарности: Мы благодарим Дж. Л. Голдберга за вдумчивые комментарии во время подготовки этой рукописи, Р. Нуссбаума за дар мышиной модели с синдромом Лоу, С.Лунки для конструкций фосфоинозитидных флуоресцентных белков и P. de Camilli для конструкций CIBN-EGFP-CAAX и mCh-CRY2-OCRL. Финансирование: Эта работа была поддержана NIH / NEI [K08-EY022058 (для YS), R01-EY025295 (для YS) и заслугой VA CX001298 (для YS)], Фондом Циглера для слепых (для YS) [R01 -EY-023295 (для YH), R01-EY024932 (YH) и R01-EY022359 (для WDS)], Премия Института исследований здоровья детей (для YS), Грант на неограниченное исследование по профилактике слепоты (Стэнфордская офтальмология), Американская глаукома Общество (Ю.S.), Ассоциация синдрома Лоу (для Ю.С.), Фонд Knights Templar Eye (для Ю.С.) и грант Центра зрения P30 Стэнфордскому офтальмологическому отделению. Ю.С. является научным сотрудником факультета детской трансляционной медицины Лори Краус Лакоб. Вклад авторов: P.P.P. разработал и провел все эксперименты и написал рукопись. J.A.A. помогал в исследованиях in vivo. B.W., T.J.K. и K.N. участвовал в разработке эксперимента и рецензировал рукопись. W.D.S. и Ю. предоставил ценные советы и экспериментальные предложения для этого исследования.Ю.С. курировал весь проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Мыши Ocrl ^{— / —} Inpp5b ^{— / —} INPP5B ^{+ / +} могут быть предоставлены соответствующим автором в ожидании научного обзора и заключенного соглашения о передаче материала. Запросы на мышь Ocrl ^{— / —} Inpp5b ^{— / —} INPP5B ^{+ / +} следует отправлять в Y.С. ([email protected]). Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Биоинспирированные массивы ресничек с программируемым невзаимным движением и метахрональной координацией

Изготовление ферромагнитных ресничек

Ферромагнитно-эластичные искусственные реснички на основе листов были изготовлены из композитных материалов из силиконового каучука (Ecoflex 00-30, Smooth-On Inc.) и магнитотвердых микрочастиц NdFeB (средний диаметр 5 мкм; MQFP-15-7, Neo Magnequench) с массовым соотношением 1: 1. Два материала были смешаны вместе, а затем вылиты на подложку из полиметилметакрилата с лентами в качестве прокладок для контроля толщины на уровне 100 мкм. Верхнюю поверхность смешанного материала соскребали однолезвийным бритвенным лезвием (рис. S1A). Композиционный материал отверждали при комнатной температуре в течение примерно 4 часов или отверждали в течение 1 часа, помещая его на горячую плиту при 60 ° C.После отверждения, как показано на рис. S1B ферромагнитные реснички были вырезаны на лазерной машине (LPKF ProtoLaser R3, LPKF Laser & Electronics AG) в соответствии с проектными размерами 1 мм на 550 мкм на 100 мкм ( L × w × t _b ), обозначенный на рис. S1C. Остальные размерные параметры на рис. S1C равны L ₁ = 300 мкм, w ₁ = 850 мкм и w ₂ = 200 мкм. Материал имеет плотность (2.00 ± 0,056) × 10 ³ кг · м ^-3 и средний модуль Юнга 144 кПа, измеренный на машине для испытаний на растяжение (серия 5940, Instron GmbH). В ходе экспериментов мы заметили, что производительность устройства достаточно высока, без каких-либо проблем с ухудшением характеристик. Динамика массива искусственных ресничек не меняется даже через несколько месяцев после его первого использования, когда приводится в действие теми же управляющими сигналами в тех же жидкостях. Согласно предыдущему исследованию, конструкции из Ecoflex 00-30 могут сохранять свои механические свойства после воздействия циклических нагрузок в течение более 10 ⁶ циклов ( 47 ).

Одновременное кодирование профилей намагничивания ресничек

Мы использовали метод с помощью зажима, описанный в нашей предыдущей работе ( 18 ), но расширили его для одновременного кодирования желаемых различных M ( s ) нескольких ферромагнитных ресничек с использованием одного намагничивающее приспособление. Рисунок S1D иллюстрирует принцип и процесс кодирования желаемых различных M ( s ) на нескольких ресничках одновременно. Чтобы получить желаемый профиль намагничивания, несколько ферромагнитных ресничек предварительно сгибают в зажимное приспособление с несколькими вырезанными частями заданной формы.Затем они намагничиваются путем приложения большого намагничивания B (величина 1,2 Тл) в направлении + x внутри магнитометра с вибрирующим образцом (EZ7 VSM, MicroSense LLC). Форма вырезанной части, соответствующей каждой ресничке, параметризована профилем локального угла наклона θijig (s), который представляет собой касательный угол на каждом элементе вдоль средней линии в вырезанной части (рис. S1D). Чтобы закодировать ϕ _i ( s ) = ϕ ⁰ ( s ) + ( i — 1) Δϕ для данной реснички, мы имеем θijig (s) = — ϕi (s).Для нескольких ресничек для одновременного кодирования желаемого M _i ( s ) в массиве обратная конструкция вырезанной части намагничивающего приспособления, таким образом, задается как xi (s) = x0i + ∫0Lcos ( ϕ0 (s) + (i − 1) Δϕ) ds (1) yi (s) = y0i + ∫0L − sin (ϕ0 (s) + (i − 1) Δϕ) ds (2)

На рисунке S3 показано, что мы закодировал желаемый M ( s ) путем сравнения измеренных и прогнозируемых магнитных полей, создаваемых намагниченной одиночной ресничкой и массивом ресничек на их поверхностях.

Сборка массивов искусственных ресничек

Рисунок S1 (E и F) иллюстрирует процедуру сборки ферромагнитных ресничек в массив. Намагниченные реснички вручную прикрепляли к приспособлению для сборки и фиксировали клеем (Loctite 401, Henkel AG) под стереомикроскопом (Stemi 508, Carl Zeiss AG). Моторизованные микроманипуляторы могут быть потенциально включены для автоматизации такой задачи в будущем.

Магнитное срабатывание ферромагнитных ресничек

Как показано на рис.S2 (A и B), вращающийся массив Хальбаха, состоящий из 12 кубических ферромагнетиков (12 мм на 12 мм на 12 мм; N42, Supermagnet.de), использовался для создания вращающегося однородного магнитного поля. Вращательное движение приводилось в действие двигателем постоянного тока (Parallax Continuous Rotation Servo, Parallax Inc.) и контролировалось встроенным контроллером (Arduino Uno, Arduino.cc). B ( т ) охарактеризован на рис. S2 (от C до E). Напряженность магнитного поля составляла около 40 мТл (на высоте 15 мм над поверхностью массива магнитов).В этой плоскости однородность магнитного поля в рабочем пространстве составляла ~ 95% в пределах круглой области диаметром 10 мм, которая покрывала весь массив искусственных ресничек в экспериментах. Матрицу искусственных ресничек фиксировали в контейнере (43 мм на 32 мм на 11 мм; рис. S2F), заполненном глицерином (объемное соотношение 99,8%), и поддерживали на специальном держателе образца над матрицей Хальбаха. Мы использовали глицерин в качестве вязкой жидкости в экспериментах, потому что он имеет высокую вязкость для создания среды с низким содержанием Re и не вызывает набухания эластичных ресничек.Жидкость имела плотность 1,257 × 10 ³ кг · м ^-3 и динамическую вязкость 0,876 Па · с при комнатной температуре 25 ° C.

Общая методика проектирования

Обзор используемых систем координат . Три системы координат в данной работе представлены на рис. S2 (A и G) и кратко изложены ниже. Во-первых, глобальная система координат { G _b} ( x _b, y _b, z _b) расположен в центре массива Хальбаха для выражения глобального магнитного поля срабатывания и местоположения массивов искусственных ресничек.Во-вторых, прикрепленная к массиву система координат { L _a} ( x , y , z ) расположена на основании искусственных ресничек. array, который используется для выражения динамики искусственных ресничек, потока жидкости и переноса частиц. Наконец, система координат с прикрепленными ресничками { L _si} ( X , Y , Z ) реснички i в массив расположен на теле реснички, который используется для описания его относительной ориентации и положения внутри массива и для выражения профиля намагниченности каждой реснички.

FSI модель одноресничной динамики . Модель FSI в 2D представлена для руководства дизайном одиночных ферромагнитно-эластичных ресничек. Движение данной реснички моделируется с использованием теории пучка Эйлера-Бернулли для больших отклонений ( 18 ) с учетом гидравлического сопротивления. В квазистатических состояниях основные уравнения приводятся ниже для реснички с одним концом, прикрепленным к граничной стенке. Для бесконечно малого элемента [ ss + d s ] реснички i ( i = 1,2,…, n ) в массиве уравнение баланса моментов в квазистатическом состояние в эйлеровом пространстве задается выражением −EI∂2θi (s, t) ∂s2 = nz · Across (Rz (θi (s, t)) Mi (s)) × B (t) + [Fh (s, t ) cos θi (s, t) −Fv (s, t) sin θi (s, t)] (3) где θ _i ( s , t ) — угол поворота в момент времени t , E — модуль Юнга, A _cross = wt _b — площадь поперечного сечения, I = tb3w / 12 — второй момент площади, n _z — единичный вектор вдоль оси + Z , B ( t ) = B _m [cos (ω t ) sin (ω t ) 0] ^T is вращательное внешнее магнитное поле в плоскости X — Y , M _i 90 139 ( s ) = [ M _ix ( s ) M _iy ( s ) 0] ^T — функция профиля намагничивания, а F ( s , t ) = [ F _h F _v ] ^T — внутренняя сила ресничек.

Уравнение баланса сил равно − 1Anormal∂F (s, t) ∂s = Fd (4), где A _normal = wds — это боковая площадь бесконечно малого элемента, а F _d — сила сопротивления жидкости, приходящаяся на единицу объема на бесконечно малый элемент. F _d является функцией местного коэффициента сопротивления C _d , принимая геометрию цилиндра, основанную на местных кривизнах ( 48 ) и относительной скорости между элементом и потоком жидкости. F _d дополнительно определяется как Fd = −12Cd¯ρf∣u∣u Anormal / (Acrossds) = — 12Cd¯ρftb∣dus (s, t) dt∣dusdt (5) Cd¯ = βCd = β [−1,5ln (Re) +7] (6) где ρ _f — это плотность жидкости, а β — масштабный коэффициент для калибровки коэффициента демпфирования, так как обычно трудно точно согласовать местный коэффициент сопротивления C _d ( 48 , 49 ). Местное значение Re определяется как Re = ∣unoslip (s, t) wρf · μf − 1, где μ _f — динамическая вязкость жидкостей.Кроме того, декартово положение ресничек u _s ( s , t ) определяется выражением ∂us (s, t) ∂s = [∂x (s, t) ∂s ∂ y (s, t) ∂s] T = [cosθi (s, t) sinθi (s, t)] T (7)

Граничные условия задаются системой уравнений x (0, t) = x0, y (0, t) = y0, θ (0, t) = θ0Fx (L, t) = 0, Fy (L, t) = 0, ∂θ∂s (L, t) = 0 (8)

начальные условия задаются другой системой уравнений x (s, 0) = x0 + ∫0scosθ0ds ′, y (s, 0) = y0 + ∫0ssinθ0ds′θ (s, 0) = θ0, Fx (s, 0) = 0, Fy (s, 0) = 0, ∂θ∂s (s, 0) = 0 (9)

Предполагается, что движения ресничек являются планарными за счет большого отношения ширины к длине ( w / L = ~ 0.6) для минимизации крутильных и изгибающих движений вне плоскости. Динамика биений одиночной реснички при вращении B ( t ) может быть предсказана с использованием вышеупомянутой модели, как показано на рис. S8.

Оптимизация отдельной реснички путем максимизации SAR . SAR оптимизирован на основе модели FSI, обсуждаемой в предыдущем разделе. Динамика отдельной реснички в вязких жидкостях является функцией M ( s ), ее физических размеров и B ( t ).Двумерный профиль намагниченности вдоль реснички i длиной L задается формулой Mix (s) = Mi (s) cosϕi (s) (10) Miy (s) = Mi (s) sin ϕi (s) ), s∈ [0, L] (11)

Сначала зафиксируем звездную величину M ( с ) как 40 кА · м ⁻¹ и предположим, что величина внешнего магнитного поля равна B _м = 40 мТл. Тогда для простоты ϕ _i ( s ) представляется в виде общей непрерывной полиномиальной функции с приближением первого порядка как ϕi (s) = ϕi (0) + [ϕi (0) −ϕi (L )] (sL), поскольку члены высокого порядка менее важны в определении динамики ресничек.Как показано на рис. S5 (A и B) мы провели систематическое сканирование параметров для полного фазового диапазона ϕ _i (0) — ϕ _i ( L ) отдельной реснички. Мы обнаружили, что максимальный положительный SAR может быть получен при ϕ _i (0) — ϕ _i ( L ) = 1,75π (используется во всех экспериментах, если не указано явно) и максимальном отрицательном SAR может быть получено, когда ϕ _i (0) — ϕ _i ( L ) = 0 (используется на рис.5). Эти два профиля намагничивания являются оптимальными в практическом диапазоне (от -1,75π до 1,75π), ограниченном методом намагничивания на основе шаблона.

Величина B _m и частота f из B ( t ) — еще два управляющих входа динамики отдельной реснички. Увеличение f увеличит SAR, но максимальное значение Re также увеличится (рис. S5C). Поэтому мы ограничили f , чтобы гарантировать, что наши массивы ресничек работают в режиме с низким содержанием Re в экспериментах.Кроме того, более крупный B _m дает больший SAR (рис. S5D) до тех пор, пока деформация реснички не будет ограничена граничными стенками.

Кроме того, на движение влияют размеры искусственной реснички. Мы определили два соотношения, отношение толщины к длине ( r _tl ) и отношение ширины к длине ( r _wl ), чтобы объяснить их влияние на основе наших моделей. r _tl имеет большое влияние на величину движения ресничек.При таких же магнитных полях срабатывания искусственные реснички с большим размером r _tl будут иметь меньший максимальный угол изгиба и меньшее SAR, как показано на рис. S9, в то время как продольное движение более очевидно, что дает большую выходную силу во время рабочего хода после деформации до того же состояния. Кроме того, r _wl оказывает меньшее влияние на движение планарных ресничек согласно формуле. 3 в разделе «FSI-модель динамики отдельной реснички», в то время как главным образом влияя на движение одной реснички вне плоскости.Увеличивая отношение ширины к длине (~ 0,6), можно минимизировать нежелательные отклонения от плоскости.

Механика и методология расчета метахронных волн . Каждый член в массиве ферромагнитных ресничек представляет собой распределенный осциллятор, подверженный вращающемуся магнитному полю B ( t ) = R _z (ω t ) B (0). Фазы этих генераторов могут быть представлены углами наклона их корпуса θ _i ( s , t ).Для двух соседних ресничек имеем следующие уравнения баланса моментов: EI∂2θi (s, t) ∂s2 = τi, zmag (θi (s, t)) + [Fh (s, t) cosθi (s, t) −Fv (s, t) sinθi (s, t)] (12) −EI∂2θi + 1 (s, t) ∂s2 = τi + 1, zmag (θi + 1 (s, t)) + [Fh ( s, t) cosθi + 1 (s, t) −Fv (s, t) sinθi + 1 (s, t)] (13)

Временные различия в изменяющихся во времени и пространственно распределенных внешних магнитных моментах τi, zmag (s, t) создают метахрональные волны. Чтобы быть более конкретным, внешние магнитные моменты, приложенные к ресничкам i и ( i + 1), выражаются как τi, zmag (s, t) = nz · Через [Rz (θi (s, t )) Mi (s)] × [Rz (ωt) B (0)], (14) τi + 1, zmag (s, t) = nz · Через [Rz (θi + 1 (s, t)) Rz ( Δϕ) Mi (s)] × [Rz (ωt) B (0)] = nz · Через [Rz (θi + 1 (s, t)) Mi (s)] × [Rz (ωt + Δϕ) B (0 )] (15)

Фазовый сдвиг Δϕ в M ( с ) может быть эквивалентно представлен как Δϕ в B ( t ) из-за математических свойств векторного произведения в 2D, как показано в уравнении .15. Следовательно, фазовые сдвиги Δt = Δϕ2πT эквивалентно производятся в колебательных движениях соседних ресничек.

Моделирование CFD в сравнении с экспериментальными данными . Чтобы смоделировать поток жидкости, создаваемый массивами искусственных ресничек, мы используем трехмерную двунаправленную CFD-модель ( 15 ), которая может точно описать магнитный момент на ресничках, деформацию ресничек и вызванный деформацией поток жидкости в низкий Re [см. рис. S6 (A и B)]. Модель учитывает полностью связанное двунаправленное взаимодействие твердого тела и жидкости между ресничками и жидкостью, включая деформацию ресничек, индуцированную жидкостью.Вычислительная структура кратко описана здесь. В модели CFD реснички представлены набором оболочечных элементов, которые действуют как внутренние границы жидкости. FSI рассматривается путем неявной связи уравнений гидродинамики и механики твердого тела, где метод Стокслета используется для учета вязкого сопротивления и реализуется с использованием подхода граничных элементов. Чтобы смоделировать деформацию ресничек, мы используем элементы оболочки с изгибом и поведением мембраны, учитываемые с помощью треугольных элементов Кирхгофа ( 50 ) и треугольников постоянной деформации со степенями свободы сверления ( 51 ), соответственно.Большая и геометрически нелинейная деформация ресничек моделируется с помощью обновленного лагранжевого подхода. Мы сосредотачиваемся на потоках при низком уровне Re и используем функции Грина ( 52 ) для моделирования движения жидкости в режиме Стокса. Твердое тело и жидкость неявно связаны граничным условием отсутствия проскальзывания.

Мы сравнили влияние фазового сдвига Δψ _x (рис. S6C) и межцилиндрового расстояния d _c (рис. S6D) на индуцирование потока жидкости в моделированном и экспериментальном сценариях.Моделирование также показывает, что антиплектические волны производят максимальный направленный поток жидкости, когда Δψx∈ [−π2, −π6], а массивы искусственных ресничек с более плотным интервалом генерируют большее Q¯x. Хотя существует расхождение в абсолютных количественных значениях из-за упрощенного предположения и приближенных параметров модели CFD, а также экспериментальных неопределенностей, результаты моделирования могут подтвердить наши экспериментальные выводы с точки зрения общих тенденций.

Кодирование метахрональных волн в массивах ресничек на изогнутых поверхностях .Метахрональная координация может быть закодирована в массивы ресничек, посаженных на изогнутую граничную стенку, используя дизайнерское правило Δβ = Δϕ + Δα. Здесь Δα = α _{i + 1} — α _i описывает изменение углов наклона вдоль изогнутой поверхности путем определения разности вращения между координатами прикрепленных ресничек { L _{s ( i + 1 )}} и { L _si} двух соседних ресничек.Распределенные магнитные моменты, индуцированные на этих ресничках, имеют соотношение τi + 1mag (s, t) = τimag [s ,, t + T2π (Δϕ + Δα)]. Следовательно, профили фазы намагниченности двух соседних ресничек в глобальной системе отсчета задаются выражением ϕi (s) = ϕ (s) + (i − 1) ∆ϕ − αi (16) ϕi + 1 (s) = ϕ (s) + i∆ϕ −αi + 1 (17)

Чтобы создать метахрональные волны на произвольных изогнутых поверхностях, ϕ _i ( s ) каждой реснички обратно спроектирован вместе с { L _si } asϕi (s) = ϕ0 (s) + (i − 1) Δϕ − αi (18) αi = α0 + atan (dyci / dxci) (19) где α0 = π8 — угол между + X _i ось { L _si} относительно направления вектора касательной к поверхности вдоль поверхности граничной стенки.В частности, в биоинспирированном массиве ресничек на рис.4, Δϕ = −π4, ϕ0 (s) = — 3π8 + 1.75π (sL) и yci = Lsin (2πxci4L), где x _ci ( i = 1,2,…, 8) был выбран с равным интервалом от −4 L до 4 L .

Масштабный анализ динамики одиночных ресничек . Сначала мы определяем VE для количественной оценки относительного масштабирования вязкого сопротивления и упругого напряжения на бесконечно малом элементе, которое определяется как VE = Viscous dragElastic stress = Cd¯ρf2tb∣u∣2wtbdsEIds | ∂2θi (s, t) ∂s2 | ∝ 6Cd¯ρfω2Etb3 | ∂2θi (s, t) ∂s2 | ∝6Cd¯ρfω2EL (20) где производная кривизны ресничек ∂2θi (s, t) ∂s2 масштабируется до L ⁻².Это уравнение показывает, что вязкость жидкости необходимо уменьшить для уменьшения демпфирующего эффекта Cd¯, когда L уменьшается.

Затем мы определяем ME для количественной оценки относительного масштабирования магнитного крутящего момента и упругого напряжения на бесконечно малом элементе, которое определяется как ME = Магнитный крутящий момент, Упругое напряжение = MBwtbdsEIds | ∂2θi (s, t) ∂s2 | ∝12MBEtb2 | ∂2θi (s, t) ∂s2 | ∝12MBE (21)

Это уравнение показывает, что те же M ( s ) и B ( t ) могут вызывать аналогичное упругое напряжение в пределах ресничка при уменьшении размера L .

Одним из практических ограничений нашей системы является то, что межбровный интервал d _c не может быть меньше длины тела. Поскольку d _c далее уменьшается, динамика искусственных ресничек может зависеть от локальных магнитных взаимодействий. Критическое расстояние между соседними ресничками является сложной функцией профиля намагниченности M ( s ), жесткости материала и величины внешних магнитных полей B ( t ).Было обнаружено, что для смягчения такого эффекта можно уменьшить величину M ( s ), увеличить модуль Юнга материала E или увеличить величину B ( t ). В будущем будут проведены дополнительные исследования этого критического расстояния.

Рисунки и данные в разделе «Физические пределы измерения потока в лево-правом органайзере»

( A ) Механосенсорный механизм 1: определение направленного потока. Сенсорные реснички (красные) слева ( L ) и справа ( R ) отклоняются вращательным потоком (стрелки).Они должны уметь различать потоки, направленные вперед и назад. ( B – C ) Суммарная доля ресничек с передней действующей силой ниже (справа, зеленый) или выше (слева, красный) значения на оси абсцисс. Пунктирные линии показывают мгновенные значения (размытые колебательными потоками соседних ресничек), пунктирные линии показывают временное среднее значение, а непрерывная линия — временное среднее и среднее по ансамблю 3 неподвижных ресничек с каждой стороны. На диаграммах показаны результаты для случайно сгенерированных ( B ) и экспериментально охарактеризованных ( C ) везикул.Результаты показывают, что для надежного обнаружения (ошибка <5%) потребуется порог чувствительности 1 × 10 ⁻¹⁹ Нм. Верхняя шкала показывает эффективную скорость сдвига потока над плоской поверхностью, которая вызывает эквивалентный крутящий момент на изолированной пассивной ресничке той же длины. ( D ) Механосенсорный механизм 2: обнаружение собственного движения реснички. Согласно этому механизму клетка может воспринимать компоненты крутящего момента, вызванные движением ее активной реснички через вязкую жидкость.Линии показывают меридиональный компонент по направлению к заднему (синий), параллельный компонент по направлению к спинному (красный) и нормальный компонент (зеленый). Меридиональная составляющая показывает среднее временное значение 10 ⁻¹⁷ Нм, что потенциально может позволить различать левую (левая панель) и правую (правая панель) стороны. ( E ) Хемосенсорный механизм, основанный на опосредованном потоком транспорте сигнальной молекулы. Частицы выделяются из области 30 ° вокруг переднего ( A ) полюса, а затем распространяются диффузно через вращающуюся жидкость.Они абсорбируются при встрече с любой ресничкой за пределами передней области. В конце концов, подсчитывают частицы, поглощенные в области 45 ° вокруг левого и правого полюсов. ( F ) Средняя концентрация частиц (в условных единицах) в экваториальной плоскости для частиц, в которых диффузия преобладает над циркуляцией жидкости (радиус Стокса = 0,5 нм, вверху), и частиц с преобладающим дрейфом (3 нм, внизу). В последнем случае хорошо видна асимметрия распределения (Видео 3). ( G – L ) Доля частиц, подсчитываемая слева, среди общего количества частиц слева и справа для различных сценариев.Пунктирной линией показан предлагаемый порог обнаружения с соотношением левого и правого 2: 1. Красная линия показывает средний пузырек, а затемненная область — интервал между 5 ^-м и 95 ^-м процентилями. ( G ) Непрерывная модель с равномерной циркуляцией (Ω = 0,5 с ⁻¹). ( H ) Распределение случайно сгенерированных ресничек с естественными параметрами. ( I ) Моделирование отдельных пузырьков на 3-SS (красный), 8-SS (индиго) и 9–14-SS (черный).( J ) То же, что и H, но с однородным распределением ресничек.

%d1%80%d0%b5%d1%81%d0%bd%d0%b8%d1%86%d1%8b PNG, векторы, PSD и пнг для бесплатной загрузки

обзор 9 видов щеточек с фото

Тушь Telescopic: гибкая и тонкая щеточка-расческа

Тушь Volumissime: прямая щеточка с густой щетиной

Тушь Bambi Eye Oversized: Силиконовая щеточка

Тушь Miss Baby Roll: спиралевидная щеточка

Тушь Volume Million Lashes So Couture: кисточка с густой щетиной

Тушь Volume Million Lashes Feline

Тушь Paradise Extatic

Тушь Unlimited

Рейтинг: туши L’Oréal Paris с лучшими, по мнению редакции, щеточками

Оксидант InLei

VECTOR

Новый метод получения живых изображений ресничек дыхательных путей человека с использованием агглютинина зародышей пшеницы

Трахея мыши

Трахея человека

Флуоресцентная маркировка трахей

Наблюдение за движением ресничек

Анализ частоты биений ресничек

Анализ направления и оси биений ресничек

Сканирующая электронная микроскопия

Добавить: pEF5B-FRT-cilia-APEX

Michelle Cilia: USDA ARS

Мишель Хек — Институт Бойса Томпсона

Оптогенетическая стимуляция фосфоинозитидов показывает критическую роль первичных ресничек в регуляции глазного давления.

Abstract

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Индуцируемое светом рекрутирование CRY2-5-ptase

Вирусная трансдукция CRY2–5-птазы

Модуляция фосфоинозитидов влияет на регуляцию кальция и цитоскелетный каркас TM-клеток

Модуляция OCRL на мышиной модели с синдромом Лоу

PI (4,5) P

ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты

Животные

Культура клеток

ДНК-плазмида и трансфекция

Иммунофлуоресценция

Конфокальная микроскопия и визуализация живых клеток

Внутриглазная инъекция

Измерение ВГД

Аппарат перфузии глаза мыши

AAV

Конструирование и производство лентивируса

Анализ сокращения клеток на основе коллагена

Статистический анализ

Биоинспирированные массивы ресничек с программируемым невзаимным движением и метахрональной координацией

Изготовление ферромагнитных ресничек

Одновременное кодирование профилей намагничивания ресничек

Сборка массивов искусственных ресничек

Магнитное срабатывание ферромагнитных ресничек

Общая методика проектирования

Рисунки и данные в разделе «Физические пределы измерения потока в лево-правом органайзере»

Добавить комментарий Отменить ответ